應(yīng)用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)比較風(fēng)干肉中細(xì)菌多樣性和微生物安全性

田建軍，張開(kāi)屏，楊明陽(yáng)，景智波，李權(quán)威，趙麗華，靳 燁,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070）

風(fēng)干肉是新疆、西藏和內(nèi)蒙古西北地區(qū)非常有特色的一種傳統(tǒng)中式肉制品，生產(chǎn)加工歷史悠久，肉經(jīng)風(fēng)干之后，肉質(zhì)松脆、口味獨(dú)特、食用方便、保藏期長(zhǎng)，產(chǎn)品深受當(dāng)?shù)赜文撩褡逡约叭珖?guó)各地消費(fèi)者的喜愛(ài)。傳統(tǒng)自然風(fēng)干肉制品是以牛、羊、馬等反芻動(dòng)物新鮮肉為主要原料，在冬季適宜的低溫和通風(fēng)良好的環(huán)境條件下，將牛羊肉割成小條，掛在陰涼處，經(jīng)90～120 d自然晾曬、風(fēng)干，去除肉中部分水分而形成的風(fēng)味獨(dú)特的肉制品，它屬于自然條件下，依靠?jī)?nèi)源酶和有益微生物的作用，發(fā)生一系列生化變化而制成的一類肉制品[1-2]。在自然晾曬的過(guò)程中，來(lái)源于原料本身和環(huán)境中的微生物，特別是一些耐低溫的乳酸菌和葡萄球菌仍然具有代謝活力，代謝產(chǎn)酸、產(chǎn)細(xì)菌素，抑菌的同時(shí)產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶，通過(guò)這些酶對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪進(jìn)行適當(dāng)降解和氧化，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的感官和食用品質(zhì)，所以傳統(tǒng)的風(fēng)干肉是一種自然發(fā)酵的、風(fēng)味獨(dú)特的發(fā)酵肉制品。

乳酸菌是最早從發(fā)酵肉制品中分離出的微生物，是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中重要的優(yōu)勢(shì)菌群，與產(chǎn)品品質(zhì)密切相關(guān)[3-4]。潘曉倩等[5]從農(nóng)家自然發(fā)酵的腌臘肉制品中分離獲得1 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）10M-7，該菌株能迅速降低腌臘肉制品發(fā)酵初期產(chǎn)品的pH值，可有效抑制發(fā)酵產(chǎn)品中大腸桿菌和葡萄球菌的數(shù)量，提高食品的安全性能。也有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在降低產(chǎn)品pH值的同時(shí)能夠賦予產(chǎn)品獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味、改善產(chǎn)品組織結(jié)構(gòu)、促進(jìn)產(chǎn)品色澤與風(fēng)味的形成[6]。同時(shí)，某些乳酸菌能產(chǎn)細(xì)菌素，抑制腐敗菌和致病菌生長(zhǎng)繁殖[7-9]，降低產(chǎn)品中某些特定生物胺的含量[10-11]。然而，絕大多數(shù)的微生物不能夠被培養(yǎng)或者很難被培養(yǎng)，導(dǎo)致傳統(tǒng)的分離、純化、鑒定檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[12]。想要全面反映自然發(fā)酵過(guò)程中微生物活動(dòng)的真實(shí)狀況，必須運(yùn)用相對(duì)更加精確的技術(shù)來(lái)研究細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的情況。

Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)可對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子同時(shí)測(cè)序，根據(jù)16S rRNA基因序列分析特定環(huán)境中微生物群體的構(gòu)成情況或基因的組成以及功能特性[13]，具有較高準(zhǔn)確性和靈敏度等優(yōu)勢(shì)[14]，現(xiàn)已被廣泛用于對(duì)許多發(fā)酵食品微生物群體結(jié)構(gòu)的分析，如奶酪、蝦醬、酸馬奶等[15-17]。目前發(fā)酵食品微生物多樣性的研究是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)，但對(duì)于傳統(tǒng)自然發(fā)酵的風(fēng)干肉的微生物結(jié)構(gòu)研究少之又少。自然發(fā)酵的風(fēng)干類肉制品通常會(huì)有來(lái)自原料以及與風(fēng)干肉制品生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)的微生物，而細(xì)菌是參與發(fā)酵肉制品發(fā)酵的主要微生物，對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)起決定性作用，所以對(duì)自然發(fā)酵風(fēng)干肉制品的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究很有必要，可為產(chǎn)品的安全生產(chǎn)提供依據(jù)。

本研究為探究傳統(tǒng)發(fā)酵風(fēng)干肉中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，在內(nèi)蒙古和新疆地區(qū)選取品質(zhì)最有代表性的樣品進(jìn)行采集。對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行高通量測(cè)序以及序列分析，進(jìn)而闡述傳統(tǒng)特色風(fēng)干肉制品中細(xì)菌種群多樣性，分析結(jié)果將對(duì)傳統(tǒng)風(fēng)干肉制品中微生物菌群特征的研究及產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)樣品發(fā)酵方式將14 個(gè)樣品劃分為group A、group B、group C、group D四組，其中g(shù)roup A和group B為不同地區(qū)的自然發(fā)酵組，group C和group D為不同方式的人工調(diào)控組，詳細(xì)分組情況如表1所示。

表 1 樣品來(lái)源及加工方式Table 1 Information about meat product samples investigated in this study

QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒 德國(guó)Qiagen公司；Phusion超保真DNA聚合酶 英國(guó)NEB公司；DNA Marker（DL9000、DL2000） 上海欣百諾生物科技有限公司；UltraSYBR Mixture 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；MiSeq Reagent Kit v3 美國(guó)Illumina公司。方式下的花青素-SPI共價(jià)聚合物與天然SPI的傅里葉紅外光譜圖進(jìn)行比較。如圖3C所示，在添加同質(zhì)量濃度（0.5 g/L）的花青素條件下，不同共價(jià)交聯(lián)方式處理花青素與SPI致使天然SPI酰胺I帶的紅外吸收峰發(fā)生藍(lán)移的程度也不同（生物酶法：1 634.38 cm-1藍(lán)移至1 631.97 cm-1；化學(xué)堿法：1 634.38 cm-1藍(lán)移至1 632.93 cm-1），這表明不同共價(jià)交聯(lián)方式可以不同程度地改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

同時(shí)利用peakfit對(duì)蛋白的酰胺I帶進(jìn)行去卷積，二階求導(dǎo)，采用Gauss面積法擬合曲線并計(jì)算得出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的種類與含量[29]，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 花青素-SPI共價(jià)聚合物中蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 Contents of protein secondary structures in the covalent conjugates of anthocyanin and SPI %

如表1所示，與天然SPI相比，所有添加花青素樣品的SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量都發(fā)生了改變，其中α-螺旋和β-折疊含量降低，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量明顯升高（P＜0.05），這可能是由于蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊逐漸轉(zhuǎn)換為β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲。這與之前的研究[30]結(jié)果一致。在添加同質(zhì)量濃度花青素條件下，生物酶法交聯(lián)得到的花青素-SPI共價(jià)聚合物比化學(xué)堿法交聯(lián)得到的聚合物增加β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量的趨勢(shì)更加明顯（P＜0.05），這表明生物酶法共價(jià)交聯(lián)作用比化學(xué)堿法共價(jià)交聯(lián)作用解折疊蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力更強(qiáng)，可以更大程度地使部分蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)[15]。

2.4 紫外-可見(jiàn)光譜分析

圖 4 生物酶法和化學(xué)堿法條件下花青素與SPI共價(jià)聚合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig. 4 UV-Vis absorption spectra of the covalent conjugates of anthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

蛋白質(zhì)的吸收光譜在290 nm左右處有一個(gè)主要的吸收峰，代表蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸π-π*躍遷[31]。如圖3所示，花青素的添加使SPI的紫外-可見(jiàn)吸收光譜峰值升高，且在同一種共價(jià)交聯(lián)方式條件下，SPI的吸收光譜峰值隨花青素的質(zhì)量濃度升高而增加。但在同一質(zhì)量濃度花青素條件下，生物酶法交聯(lián)的花青素-SPI共價(jià)聚合物比化學(xué)堿法交聯(lián)的聚合物峰值高。值得注意的是，花青素的添加不僅改變了SPI吸收光譜的峰值，而且使得SPI的紫外吸收光譜在290 nm波長(zhǎng)處的峰位發(fā)生了藍(lán)移，尤其在花青素質(zhì)量濃度為0.5 g/L，生物酶法交聯(lián)的聚合物峰位藍(lán)移最為明顯，由波長(zhǎng)290 nm藍(lán)移至287 nm。

研究表明，蛋白質(zhì)吸收峰峰值的大小主要反映了蛋白質(zhì)分子與其他小分子的相互作用的強(qiáng)弱，而蛋白質(zhì)吸收峰峰位的改變主要是由于蛋白質(zhì)微環(huán)境的疏水性發(fā)生改變所引起的，并且蛋白質(zhì)微環(huán)境疏水性的改變會(huì)引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[13]。根據(jù)圖4結(jié)果可知，花青素使SPI芳香族氨基酸處的微環(huán)境發(fā)生了改變，進(jìn)而誘導(dǎo)SPI多肽鏈伸展，發(fā)生解折疊。同一共價(jià)交聯(lián)方式下，隨著花青素質(zhì)量濃度升高，花青素與SPI的共價(jià)相互作用越強(qiáng)；而同一質(zhì)量濃度花青素條件下，生物酶法交聯(lián)比化學(xué)堿法交聯(lián)更能促進(jìn)花青素與SPI的共價(jià)相互作用。

2.5 熒光光譜分析

圖 5 生物酶法和化學(xué)堿法條件下花青素與SPI共價(jià)聚合物的熒光光譜圖Fig. 5 Emission fluorescence spectra of the covalent conjugates of anthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

蛋白質(zhì)被認(rèn)為具有固有的發(fā)射熒光，主要是由于它們的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，苯丙氨酸可以忽略，當(dāng)這些芳香族殘基暴露于不同的溶劑條件下時(shí)，熒光發(fā)射光譜特征會(huì)改變[13]。如圖5所示，花青素與SPI的共價(jià)交聯(lián)使得SPI的熒光強(qiáng)度發(fā)生了猝滅現(xiàn)象，并且花青素質(zhì)量濃度越高，SPI的熒光強(qiáng)度猝滅現(xiàn)象越明顯。同一花青素質(zhì)量濃度，生物酶法條件下花青素對(duì)SPI熒光強(qiáng)度的猝滅程度高于化學(xué)堿法條件。這說(shuō)明生物酶法條件下和化學(xué)堿法條件下花青素與列鑒定聚類分析后，共得到466 975 條優(yōu)化序列，每個(gè)樣品平均產(chǎn)生33 355 條優(yōu)化序列。以抽到的序列條數(shù)（測(cè)序深度）與其所聚類得到OTU數(shù)（97%相似性）和Shannon指數(shù)繪制曲線，即可得到稀釋性曲線和Shannon指數(shù)曲線。

由圖1可知，OTU數(shù)隨著測(cè)序量的深入而增加，Shannon指數(shù)曲線也伴隨著持續(xù)上升。隨著逐漸增大測(cè)序量，OTU數(shù)沒(méi)有達(dá)到平衡仍有上升的趨勢(shì)，而Shannon指數(shù)曲線已經(jīng)完全達(dá)到飽和狀態(tài)，這說(shuō)明雖然隨著測(cè)序量的增加可能會(huì)有新的OTU和種系被發(fā)現(xiàn)，但是在此測(cè)序深度水平下，足以充分展現(xiàn)樣品中細(xì)菌的多樣性。對(duì)14 組發(fā)酵肉制品所含細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序分析，當(dāng)測(cè)序量低于10 000時(shí)，OTU數(shù)呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)的測(cè)序量仍有較多物種沒(méi)有被檢查到。當(dāng)測(cè)序數(shù)量逐漸增加時(shí)，樣品的OTU數(shù)均增加，但趨勢(shì)趨于平緩，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到40 000 條時(shí)，所有樣品OTU變化均已趨于平緩，隨著測(cè)序量的增加，細(xì)菌多樣性幾乎不再隨之發(fā)生變化，說(shuō)明現(xiàn)有測(cè)序量已經(jīng)可以反映出樣品中細(xì)菌豐度信息。

2.2 樣本OTU分布

圖 2 不同樣品OTU數(shù)與分布圖Fig. 2 Distribution of OTUs number in different samples

在97%相似水平下，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，OTU數(shù)可以反映出樣品中細(xì)菌的豐度[18]，由圖2可知，西藏山南市瓊結(jié)縣自然風(fēng)干牛肉RQ_3的OTU數(shù)最多，說(shuō)明所含有的細(xì)菌種類最豐富，共有OTU數(shù)為471，西藏林芝江達(dá)縣自然風(fēng)干牛肉TR_1和TR_2的OTU數(shù)最為接近，分別為188和187。內(nèi)蒙古烏拉特中期自然風(fēng)干羊肉中細(xì)菌的種類相對(duì)豐富，BY_1、BY_2和BY_3的OTU數(shù)分布在361～265之間。內(nèi)蒙古呼和浩特市采集的臘肉LR_2的OTU數(shù)為146，而在呼和浩特市采集的臘腸樣品L、LS_1和實(shí)驗(yàn)室通過(guò)添加發(fā)酵劑進(jìn)行工人調(diào)控的發(fā)酵香腸S_200和S_302的OTU分布在67～78 個(gè)之間。其中在同一環(huán)境條件下添加發(fā)酵劑的S_200和S_302較不添加發(fā)酵劑的對(duì)照組NS_1的OTU數(shù)要低。由此可見(jiàn)，通過(guò)添加發(fā)酵劑，可以減少發(fā)酵香腸中細(xì)菌的種類。這可能是發(fā)酵劑中乳酸菌快速產(chǎn)酸或產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)其他微生物產(chǎn)生了抑制作用。美國(guó)的西式發(fā)酵香腸HT的OTU數(shù)相對(duì)較低，為60。新疆熏馬腸XMC的OTU數(shù)最低，僅為40，可能與生產(chǎn)工藝的煙熏有關(guān)。有研究表明，煙熏能夠選擇性地抑制腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）等腐敗微生物，延長(zhǎng)保質(zhì)期[19]。對(duì)以上14 個(gè)樣品細(xì)菌豐度進(jìn)行比較，樣品中細(xì)菌豐度大致可歸為5 類，RQ_3樣品豐度值最高（471），樣品中細(xì)菌的多樣性程度明顯比其他樣品要高，BY_1次之（361），BY_2（265）和BY_3（286）、TR_1（188）和TR_2（187）基本相近，XMC（40）樣品豐度值最低，可見(jiàn)不同地區(qū)、相同地區(qū)不同的處理方法，樣品的細(xì)菌豐度分布差異較大。

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)，本實(shí)驗(yàn)選用相似度為97%的OTU，結(jié)果如圖3所示，可以直觀表現(xiàn)出樣本間OTU數(shù)組成的相似性及其重疊情況。

圖 3 樣品中細(xì)菌群落共享和獨(dú)有的OTU的Veen分析Fig. 3 Veen diagram representation of shared and exclusive OTUs from bacterial community in different samples

由圖3可知，西藏地區(qū)自然發(fā)酵樣品（group A）中OTU總數(shù)目為650，其中獨(dú)有的OTU數(shù)為322，內(nèi)蒙古烏拉特中旗自然發(fā)酵樣品（group B）中OTU數(shù)為583，其中獨(dú)有的OTU數(shù)為245，group A和group B中共有的OTU數(shù)為291。人工調(diào)控實(shí)驗(yàn)室自制樣品（group C）中OTU數(shù)為147，其中獨(dú)有的OTU數(shù)為1，人工調(diào)控市售樣品（group D）中OTU數(shù)為203，其中獨(dú)有的OTU數(shù)為30，group C和group D中共有的OTU數(shù)為91。group A、group B、group C、group D四組樣品中共有的OTU數(shù)為73。

結(jié)合圖2和圖3分析可知，自然發(fā)酵風(fēng)干肉制品中細(xì)菌的種類比人工調(diào)控發(fā)酵肉制品豐富，人工調(diào)控過(guò)程中不添加發(fā)酵劑比添加發(fā)酵劑的細(xì)菌豐富。不經(jīng)過(guò)煙熏比經(jīng)過(guò)煙熏的細(xì)菌種類豐富。聚類出的OTU數(shù)表現(xiàn)出一定的地區(qū)差異性，在數(shù)量上基本表現(xiàn)為傳統(tǒng)自然風(fēng)干肉＞人工調(diào)控風(fēng)干肉、中式發(fā)酵肉制品＞西式發(fā)酵香腸、非煙熏發(fā)酵肉制品＞煙熏發(fā)酵肉制品。

Venn圖中多個(gè)樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，所包含的微生物序列數(shù)和所占比例如表2所示。由表2可知，樣本中OTU總數(shù)為975，包含的序列總數(shù)為466 975。其中4 組樣品（group A、group B、group C、group D）共有的OTU數(shù)為73，所包含的序列數(shù)為362 630，占比78%，所占比例最高，其中豐度值大于1%且豐度值由高到低的OTU分別為：OTU 1、OTU 5、OTU 2、OTU 3、OTU 7、OTU 12、OTU 9、OTU 6、OTU 8、OTU 13、OTU 10、OTU 11（表2）。

表 2 樣品中OTU數(shù)、序列數(shù)及其占比Table 2 OTU number, sequence number and their proportions in samples

表 3 主要OTU分布及物種信息Table 3 Main OTU distribution and species information

由表3可知，group A、group B、group C、group D四組樣品中，豐度值最高的為OTU 1，序列數(shù)占比為37%，物種信息為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）乳桿菌屬（Lactobacillus）的清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），OTU 5和OTU 2所包含的序列數(shù)占比均為6%，物種信息分別為Firmicutes的葡萄球菌屬（Staphylococcus）和乳酸乳球菌屬（Lactococcus）的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。OTU 3包含序列占比為3%，物種信息為變形菌門(mén)（Proteobacteria）假單胞菌屬（Pseudomonas）的莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）。OTU 7包含序列占比為3%，屬于藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）生物。OTU 4、OTU 12、OTU 9、OTU 6各自包含的序列數(shù)占比均為2%，其中OTU 4、OTU 12分別為Firmicutes的魏斯氏菌屬（Weissella）和腸球菌屬（Enterococcus），OTU 9、OTU 6分別為Proteobacteria不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）的約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii）和Anaplasma屬的Anaplasma ovis。OTU 8、OTU 13、OTU 10、OTU 11序列數(shù)占比均為1%，其中OTU 13為Proteobacteria，其余OTU 8、OTU 10、OTU 11均為Firmicutes。由以上分析可知，樣品中微生物豐度高的物種主要集中在Firmicutes和Proteobacteria。Firmicutes中以Lactobacillus sakei為最高，其次為Staphylococcus和Lactococcus lactis。

2.3 Alpha多樣性指數(shù)分析

圖 4 微生物多樣性指數(shù)分析Fig. 4 Microbial diversity indexes

樣品的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)可以反映出樣品微生物群落分布豐度，由圖4可以看出，4 組樣品中g(shù)roup B的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)是最大的，這說(shuō)明內(nèi)蒙古烏拉特中期采集的風(fēng)干肉中細(xì)菌物種豐度最高，且明顯高于group C和group D（P＜0.05）。樣品的Simpson和Shannon指數(shù)可以反映出樣品中微生物群落分布的多樣性，其中Shannon指數(shù)越大，表明微生物群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)越大，表明微生物群落多樣性越低。由圖4分析發(fā)現(xiàn)，人工調(diào)控組的微生物結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于自然發(fā)酵組，通過(guò)進(jìn)一步對(duì)group A和group B的微生物多樣性進(jìn)行Alpha多樣性分析，Anova分析說(shuō)明4 組之間差異顯著（P＜0.01），兩兩分析結(jié)果顯示只有g(shù)roup B和group C、group B和group D之間差異顯著（P＜0.05），其他兩兩組間差異不顯著。

2.4 優(yōu)勢(shì)菌在門(mén)水平上的群落結(jié)構(gòu)與微生物安全性分析

圖 5 門(mén)水平物種分布柱狀圖Fig. 5 Phylum distribution statistics

不同樣品中細(xì)菌在細(xì)菌分類門(mén)水平上的分布情況如圖5所示。在自然發(fā)酵的6 個(gè)樣品中（TR_1、TR_2、RQ_3和BY_1、BY_2、BY_3）共鑒定出21 個(gè)細(xì)菌門(mén)，平均豐度值大于1%的有5 個(gè)門(mén)，分別為：Firmicutes 39%、Proteobacteria 40%、Bacteroidetes 14%、Actinobacteria 4%、Cyanobacteria 1%，這5 個(gè)菌門(mén)細(xì)菌含量占到測(cè)序序列總數(shù)的97%，另外在RQ_3、BY_1、BY_2和BY_3樣品中發(fā)現(xiàn)沒(méi)有劃分門(mén)（unclassified）的細(xì)菌，其平均豐度值為0.2%。在人工調(diào)控的8 個(gè)樣品中（NS_1、S_200、S_302、LS_1、LR_2、L、XMC、HT）共鑒定出14 個(gè)細(xì)菌門(mén)，平均豐度值大于1%的僅有3 個(gè)門(mén)，F(xiàn)irmicutes 92%、Proteobacteria 4%和Cyanobacteria 4%。從自然發(fā)酵和人工調(diào)控樣品細(xì)菌的分布情況來(lái)看，自然發(fā)酵樣品中Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，所占比例均超過(guò)了10%，人工調(diào)控樣品中僅Firmicutes為優(yōu)勢(shì)菌群，所占比例高達(dá)92%。

革蘭氏染色反應(yīng)陽(yáng)性的Firmicutes和革蘭氏染色陰性的Bacteroidetes是人類腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)有益菌。Haberman等[20]對(duì)359 名炎性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者進(jìn)行腸道菌群分析，發(fā)現(xiàn)IBD患者回腸中Firmicutes豐度降低，Proteobacteria豐度增加。這可能提示Firmicutes豐度降低與具有抗炎潛力的優(yōu)勢(shì)菌豐度減少相關(guān)，Proteobacteria豐度增加與致病菌豐度增加相關(guān)。近些年來(lái)研究顯示，短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）主要包括乙酸、丙酸、丁酸，約占SCFAs總量的90%以上，對(duì)人體的健康有重要作用[21-22]。丙酸為是Bacteroidetes發(fā)酵的主要產(chǎn)物，丁酸主要由Firmicutes代謝產(chǎn)生[23-24]。由此推斷，菌群結(jié)構(gòu)不同的發(fā)酵肉制品，乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸代謝產(chǎn)物有所差異，進(jìn)而對(duì)維持機(jī)體健康影響產(chǎn)生不同影響。而Proteobacteria包括大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌很多病原菌[25]，在某種程度上對(duì)風(fēng)干肉具有潛在的危害性。因此，為控制這些安全隱患，可以從原料肉的處理、發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵溫度等生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)，將生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化以此降低有害微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。這對(duì)于保證風(fēng)干肉的質(zhì)量與安全，提高風(fēng)干肉的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。

2.5 優(yōu)勢(shì)菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)與微生物安全性分析

圖 6 屬水平物種分布柱狀圖Fig. 6 Genus distribution statistics

不同樣品中細(xì)菌在屬水平上的分布情況如圖6所示。自然發(fā)酵的6 個(gè)樣品（TR_1、TR_2、RQ_3和BY_1、BY_2、BY_3）共鑒定出241 個(gè)細(xì)菌屬，相對(duì)含量大于1.0%的屬有16 個(gè)，其中屬于Firmicutes和Proteobacteria的各為8 個(gè)。另外，unclassified的細(xì)菌總量占細(xì)菌菌群總量的37.99%。屬于Firmicutes的細(xì)菌屬分別為：Lactobacillus 4%、Staphylococcus 2%、動(dòng)性球菌屬（Planococcus）2%、Jeotgalicoccus 2%、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）1%、乳球菌屬（Lactococcus）1%、Atopostipes 1%、鏈球菌屬（Streptococcus）1%。屬于Proteobacteria的細(xì)菌屬分別為： Pseudomonas 9%、Acinetobacter 4%、紅孢子蟲(chóng)屬（Anaplasma）3%、馬賽菌屬（Massilia）3%、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）2%、玫瑰色半光合菌屬（Roseateles）2%、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）2%、食單胞菌屬（Stenotrophomonas）1%。人工調(diào)控的8 個(gè)樣品（NS_1、S_200、S_302、LS_1、LR_2、L、XMC、HT）共鑒定出102 個(gè)細(xì)菌屬，相對(duì)含量大于1.0%的屬有8 個(gè)，都屬于Firmicutes。另外，unclassified的細(xì)菌總量占到細(xì)菌菌群總量的6%。屬于Firmicutes的各菌屬分別為：Lactobacillus 62%、Lactococcus 9%、Staphylococcus 8%、Weissella 5%、Enterococcus 3%、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）2%、球菌屬（Macrococcus）1%、明串珠菌屬（Leuconostoc）1%。

發(fā)酵肉制品在發(fā)酵和成熟過(guò)程中，乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococcus，CNS）被認(rèn)為是2 個(gè)主要的微生物，對(duì)發(fā)酵肉制品品質(zhì)特性至關(guān)重要[26-27]。乳酸菌如清酒乳桿菌（L. sakei）和植物乳桿菌（L. plantarum）可以使發(fā)酵肉制品酸化，有些菌株可能也有蛋白酶和脂肪酶活性；CNS如木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）具有較強(qiáng)的蛋白酶和脂肪酶活性，可以分解蛋白質(zhì)和脂肪產(chǎn)生多肽、游離氨基酸和游離脂肪酸，對(duì)發(fā)酵肉制品的質(zhì)地和風(fēng)味起主要作用[28]。Tabanelli等[27]研究發(fā)現(xiàn)，S. xylosus和S. carnosus具有硝酸鹽還原酶活性，可以促進(jìn)發(fā)酵肉制品的發(fā)色作用。Wang Xinhui等[29]研究發(fā)現(xiàn)S. xylosus具有胺氧化酶活性而可以有效地降低組胺和其他生物胺的含量。

自然發(fā)酵與人工調(diào)控樣品細(xì)菌多樣性在屬水平上差異顯著（P＜0.05）。作為許多食品自然發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群，乳酸菌被認(rèn)為是安全的[30]，其他菌屬可能存在安全隱患。Proteobacteria的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種常見(jiàn)的條件致病菌，屬于非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌[31]。Proteobacteria的靜止嗜冷桿菌（Psychrobacter immobilis）屬于革蘭氏陰性低溫貯存條件下的腐敗菌[32]。Acinetobacter屬鮑曼不動(dòng)桿菌是條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)易引起機(jī)體感染的革蘭氏陰性球桿菌。

3 結(jié) 論

本研究利用Illumina MiSeq第二代測(cè)序技術(shù)，從基因組的水平上解析風(fēng)干肉制品微生物群落結(jié)構(gòu)，突破了很多微生物尚不能利用培養(yǎng)基進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸，證實(shí)風(fēng)干肉制品中確實(shí)存在一定豐度的細(xì)菌，屬于微生物參與發(fā)酵的發(fā)酵肉制品，顯示出高通量技術(shù)在風(fēng)干肉制品微生物研究中的可行性及明顯優(yōu)勢(shì)，通過(guò)探討風(fēng)干肉中的細(xì)菌群落組成，可以把握風(fēng)干肉中優(yōu)勢(shì)菌群的分布情況，了解優(yōu)勢(shì)菌群會(huì)對(duì)風(fēng)干肉的質(zhì)量與安全以及品質(zhì)產(chǎn)生的影響，可為其他研究者開(kāi)展同類研究提供參考。

本研究共獲得466 975 條優(yōu)化序列，每個(gè)樣品平均產(chǎn)生33 355 條優(yōu)化序列。OTU數(shù)最多的為471，最少的為40，平均為170。對(duì)風(fēng)干肉進(jìn)行微生物多樣性分析后在自然發(fā)酵的6 個(gè)樣品中（group A和group B）共鑒定出21 個(gè)細(xì)菌門(mén)，平均豐度值大于1%的有5 個(gè)門(mén)，分別為Firmicutes（39%）、Proteobacteria（40%）、Bacteroidetes（14%）、Actinobacteria（4%）和Cyanobacteria（1%），這5 個(gè)菌門(mén)的含量共占到測(cè)序序列總數(shù)的97%。在人工調(diào)控的8 個(gè)樣品中（group C和group D）共鑒定出14 個(gè)細(xì)菌門(mén)，平均豐度值大于1%的僅有3 個(gè)門(mén)，分別為 Firmicutes（92%）、Proteobacteria（4%）和Cyanobacteria（4%）。其中Firmicutes為自然發(fā)酵和人工調(diào)控樣品共同的優(yōu)勢(shì)菌群。自然發(fā)酵與人工調(diào)控樣品分別鑒定出241 個(gè)和102 個(gè)細(xì)菌屬，細(xì)菌多樣性在屬水平上差異顯著（P＜0.05）。人工調(diào)控的8 個(gè)樣品（NS_1、S_200、S_302、LS_1、LR_2、L、XMC、HT）相對(duì)含量大于1.0%的屬有8 個(gè)，都屬于Firmicutes。自然發(fā)酵的6 個(gè)樣品（TR_1、TR_2、RQ_3和BY_1、BY_2、BY_3）相對(duì)含量大于1.0%的屬有16 個(gè)，其中屬于Firmicutes和Proteobacteria的各為8 個(gè)。Proteobacteria中的Pseudomonas、Acinetobacter、Psychrobacter中革蘭氏陰性菌多為致病菌或腐敗菌，對(duì)發(fā)酵制品存在安全隱患。

我國(guó)傳統(tǒng)的風(fēng)干肉是大眾化的即食肉制品。但是多數(shù)地區(qū)風(fēng)干肉在生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)原料肉不做殺菌處理，衛(wèi)生質(zhì)量主要依靠原料肉自身和周邊的環(huán)境條件，原料肉容易被致病菌或腐敗菌的污染。因此，發(fā)酵肉制品因被致病菌或腐敗菌污染而引起的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)該被廣泛關(guān)注。