基于重組Erns蛋白的牛病毒性腹瀉病毒間接ELISA檢測方法的建立

肖盛中，馬振國，李 巖，馬旭升，李 爽，楊若松，盛金良*

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.北京維德維康生物技術(shù)有限責(zé)任公司，北京 100095)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)，為單鏈正股 RNA 病毒，是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的代表種，該病毒引起的牛病毒性腹瀉—粘膜病發(fā)病率高，致死率低，病牛常出現(xiàn)發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、白細(xì)胞減少、腹瀉、咳嗽等主要癥狀，懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒。目前我國BVDV 感染比較普遍，尤其規(guī)?；隹贵w檢出率是散養(yǎng)牛場抗體檢出率的6 倍多[1]。BVDV 感染懷孕母畜后造成胎兒免疫耐受進(jìn)而發(fā)展為持續(xù)性感染(PI)，PI 胎兒出生后即為 PI 牛。PI 牛常年帶毒排毒，是牛群中BVDV 感染的主要傳播來源。近年對新疆地區(qū)BVDV 抗體和抗原的檢測及流行病學(xué)調(diào)查表明BVDV 感染已在新疆廣泛存在，并且根據(jù)BVDV 5'-UTR 的高突變性已有研究顯示在新疆存在不同基因型的BVDV[2-3]。

Erns(E0 或gp48)是組成病毒的囊膜糖蛋白之一，含有8 個(gè)可糖基化位點(diǎn)，去糖基化分子量約27 ku，可以與細(xì)胞表面黏多糖特異性結(jié)合，且與被感染細(xì)胞的可溶性病毒顆粒分泌相關(guān)[4]。此外Erns為瘟病毒屬特有，具有 RNase 活性，對單鏈和雙鏈 RNA 的降解具有促進(jìn)作用，在感染細(xì)胞的RNA 合成調(diào)控中有著重要影響，可在病毒感染初期削弱宿主的免疫防御[5]。無論是控制BVDV 感染的抗病毒藥物研發(fā)方面，還是抗體檢測方面，Erns蛋白均具有重要意義[6]。本實(shí)驗(yàn)通過對新疆地區(qū)BVDV 流行株的基因序列分析及Erns結(jié)構(gòu)蛋白抗原優(yōu)勢表位的預(yù)測，利用大腸桿菌表達(dá)了重組蛋白Erns，建立基于Erns蛋白的 BVDV 間接 ELISA 方法，對新疆地區(qū) BVDV 血清抗體檢測和血清流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 肛拭子樣品與被檢血清均采集于新疆石河子、沙灣和克拉瑪依地區(qū)某規(guī)模化牛場腹瀉病牛，BVDV 陽性血清(經(jīng)美國IDEXX 公司抗體診斷試劑盒檢測為陽性)和BVDV 陰性血清也均來自以上牛場；牛布魯氏菌(BR)、?？谔阋?FMD)、牛支原體(MB)、牛副結(jié)核(Map)及牛傳染性鼻氣管炎(IBR)陽性血清由石河子大學(xué)人畜共患病實(shí)驗(yàn)室保存。

總RNA 提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；RT-PCR 試劑盒購自Promega 公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ與HindⅢ、DNA Marker、T4 DNA 連接酶等均購自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白Marker 購自 TRAN 公司；質(zhì)粒 DNA 純化試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；BVDV 抗體檢測試劑盒購自美國 IDEXX 公司(D341)；96 微孔板購自 Thermo 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗牛IgG(IgG-HRP)購自美國Jackson ImmunoResearch 公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的BVDV 全長基因序列，合成擴(kuò)增Erns部分抗原表位基因引物，序列如下：P1：5'-CCCATATGGAGAAC ATCACACAATGGAATC-3'/P2：5'-CCCAAGCTTTG CGTACGCCCCGAACCAT (下劃線分別為NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))，預(yù)期擴(kuò)增目的片段為 681 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司合成。

1.3 BVDV-Erns基因的PCR 擴(kuò)增及重組表達(dá)載體pET-30a-Erns的構(gòu)建 參照RNA 抽提試劑盒操作說明抽提肛拭子樣本總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以cDNA為模板，P1/P2為引物PCR擴(kuò)增 BVDV-Erns基因。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、53 ℃30 s、72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化，克隆至 pMD18-T 載體，構(gòu)建重組載體 pMD-18T-Erns。將pMD-18T-Erns經(jīng)NdeⅠ、HindⅢ雙酶切，回收目的片段克隆于經(jīng)同樣酶切處理的pET-30a 中，構(gòu)建重組質(zhì) 粒 pET-30a-Erns。將 pET-30a-Erns轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂于含卡那霉素的培養(yǎng)基板上37 ℃過夜培養(yǎng)，選取生長良好的陽性菌落進(jìn)行菌液PCR 與測序鑒定。

1.4 重組蛋白的表達(dá)及抗原性鑒定 陽性菌培養(yǎng)至OD450nm值達(dá)對數(shù)生長期時(shí)加入終濃度為1 mmol/mL的 IPTG 誘導(dǎo) 6 h，經(jīng) SDS-PAGE 檢測重組蛋白的表達(dá)情況。表達(dá)后的重組蛋白利用親和層析(Ni-IDA樹脂)純化；以 BVDV 陽性血清(1:50)為一抗，以兔抗牛IgG-HRP為二抗(1∶8 000)，western blot 檢 測重組蛋白的反應(yīng)原性。

1.5 ELISA 方法的的建立 采用方陣法確定抗原最佳包被濃度(0.0125 μg/ 孔 、0.025 μg/ 孔、0.05 μg/孔、0.1 μg/ 孔、0.2 μg/ 孔和 0.4 μg/ 孔)、陰 / 陽性血清最佳稀釋度( 1∶25、1∶50、1∶100 和 1∶200)、兔抗 牛 IgG-HRP最佳稀釋度(1∶5 000、1 ∶10 000 和1∶20 000)、封閉液及其濃度(1 %酪蛋白、5 %脫脂乳、1 % BSA、0.1 %海藻糖、0.5 %明膠、1 %馬血清、3 %馬血清和5 %馬血清)、陰/ 陽性血清最佳稀釋液(PBS、1 %馬血清，3 %馬血清和5 %馬血清)、兔抗牛 IgG-HRP 反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度均為30 min、37 ℃，底物顯色時(shí)間 10 min。選擇 P/N 值(陽性樣本 OD450nm值 / 陰性樣本 OD450nm值)最大的孔對應(yīng)的反應(yīng)條件，為最佳條件。

1.6 臨界值的確定 利用建立的間接ELISA 方法對 46份健康牛血清進(jìn)行檢測，計(jì)算 S/P 值(樣本OD450nm值 / 陽性對照 OD450nm值)，及 S/P 的平均值 和標(biāo)準(zhǔn)差 SD，當(dāng)被檢樣本 S/P 值≥+2SD 時(shí)判為陽性，S/P 值時(shí)判為陰性。

1.7 特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化的間接ELISA 方法對BVDV 陰陽性血清、BR、牛 FMD、牛 MB、Map 和IBR 陽性血清同時(shí)進(jìn)行檢測，根據(jù)S/P 值判斷反應(yīng)結(jié)果，評價(jià)本試驗(yàn)建立方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 將1份 BVDV 陽性血清進(jìn)行 2倍倍比稀釋(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400)，利用優(yōu)化后的間接 ELISA 方法進(jìn)行檢測，計(jì)算能夠檢出陽性血清的最高稀釋度。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 利用建立的ELISA 方法對已知的8份不同效價(jià)血清，每份血清做 3組重復(fù)，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；選擇5 塊不同包被時(shí)間的ELISA板，對上述 8份血清樣本，每份做 3組重復(fù)，進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.10 與商品化試劑盒的比較試驗(yàn) 利用所建立的間接 ELISA 方法和美國 IDEXX 公司的 BVDV ELISA 抗體結(jié)果并檢測試劑盒同時(shí)檢測156份臨床牛血清樣本，比較檢測結(jié)果并計(jì)算二者符合率。

同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室建立的方法對新疆石河子、沙灣、塔城等地區(qū)5 個(gè)未接種BVDV 疫苗的牛場采集的564份牛血清樣品進(jìn)行BVDV 抗體檢測，計(jì)算其陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 BVDV-Erns基因的RT-PCR 擴(kuò)增 以牛肛拭子樣品中反轉(zhuǎn)錄得到的總cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增Erns基因，結(jié)果顯示在約 700 bp 出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期相符(圖1A)。表明 PCR 擴(kuò)增得到 Erns基因。

2.2 重組表達(dá)載體pET-30a-Erns的鑒定 重組質(zhì)粒 pET-30a-Erns經(jīng)NdeⅠ/Hind Ⅲ酶切鑒定顯示，得到約700 bp 的片段和約4 900 bp 的質(zhì)粒片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1B)。測序結(jié)果與目的序列符合，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a-Erns。

圖1 Erns 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果與表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Amplification of Erns gene by PCR and identification of the pET-30a-Erns by restriction enzyme digestions

2.3 Erns重組蛋白的表達(dá)與鑒定 重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo) 6 h 后，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白相對分子質(zhì)量約為26 ku，與理論分析值相符合(圖2A)。表明目的蛋白正確表達(dá)。Western blot 結(jié)果顯示通過原核表達(dá)的Erns重組蛋白能夠被BVDV 陽性血清中的特異性抗體所識(shí)別(圖2B)，表明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為ELISA 檢測抗原。

圖2 Erns 重組蛋白表達(dá)的檢測(A)與鑒定(B)Fig.2 The detection (A) and identification (B)of the rErns expression

2.4 間接ELISA 檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)方陣滴定試驗(yàn)對間接ELISA 各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)反應(yīng)條件見表1。

2.5 臨界值的確定 46份陰性血清的S/P 平均值為0.060±0.030，經(jīng) SPSS Kolmogorov-Smirnova 檢驗(yàn)分析，呈正態(tài)分布(圖3)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，陽性臨界值+2SD 為 0.12，即當(dāng)待檢樣本 S/P 值≥0.12 時(shí)判定為陽性，S/P 值＜0.12 時(shí)判定陰性。

2.6 特異性試驗(yàn) 采用建立的間接ELISA 檢測方法對 BR、FMD、MB、Map、IBR、BVDV 的陽性血清及BVDV 陰性血清進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示僅BVDV陽性血清 S/P 值≥0.12，為陽性，其余均為陰性(表2)。Erns抗原與以上病毒、細(xì)菌及支原體的陽性血清無交叉反應(yīng)。表明該方法具有較強(qiáng)的特異性。

表1 間接ELISA 檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the indirect-ELISA

圖3 陰性樣品正態(tài)分布圖Fig.3 The normal distribution of negative serum samples

表2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The specificity test of the indirect ELISA

2.7 敏感性試驗(yàn) 采用建立的間接ELISA 檢測方法對不同稀釋度的陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示當(dāng)陽性血清稀釋到1∶1 600 時(shí)，二抗1∶10 000稀釋 ，S/P 判定值仍然高于臨界值0.12 (表3)，表明該方法的敏感性較高。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 將8份不同血清樣品分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示其變異系數(shù)分別為3.66 %～9.89 %和1.23 %～9.47 %，變異范圍均小于10 % (表4)。表明建立的ELISA 檢測方法具有良好的重復(fù)性。

2.9 臨床樣品檢測結(jié)果 利用所建立的間接ELISA檢測方法和美國IDEXX 公司的BVDV ELISA 抗體檢測試劑盒同時(shí)檢測150份臨床牛血清樣本，結(jié)果顯示兩者的陽性符合率為86.45 %，陰性符合率為91.04 %，總符合率為 88.67 % (表5)。表明所建立的間接ELISA 檢測方法與IDEXX BVDV ELISA抗體檢測試劑盒的總體符合率較高，檢測結(jié)果比較可靠。

表3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The sensitivity test of the indirect ELISA

表4 間接ELISA 重復(fù)性試驗(yàn)(n=8)Table 4 The repetition tests of the indirect ELISA (n=8)

表5 血清樣品的間接ELISA 與IDEXX 試劑盒檢測方法比較Table 5 The comparison of serum detection by indirect ELISA and IDEXX kit

利用本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA 對采集的564份血清樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示5 個(gè)牛場抗體陽性率分別為：11.76 %、13.04 %、82.76 %、77.96 %、75.82 % (表6)，表明新疆部分地區(qū)規(guī)?；鯞VDV 抗體陽性率較高。

表6 5 個(gè)牛場臨床樣品檢測結(jié)果Table 6 The detection of clinical samples from 5 cattle farms

3 討論

BVDV 臨床發(fā)病率高，癥狀復(fù)雜，可跨物種傳播，給整個(gè)畜牧行業(yè)帶來嚴(yán)重安全隱患[7]。同時(shí)BVDV 不僅降低青年牛的生產(chǎn)能力，也對牛血清、凍精、冷凍胚胎和細(xì)胞等“ 牛源”生物制品質(zhì)量安全存在著嚴(yán)重的威脅[8]。其中PI 牛作為主要傳染源，更是牛制品行業(yè)的隱形殺手。所以PI 動(dòng)物的診斷清除，是BVDV 防控中的重中之重，也是凈化控制中的基本要素。間接ELISA 是血清學(xué)檢測方法中具有較高敏感性和特異性的檢測方法之一，檢測結(jié)果較為準(zhǔn)確客觀。

目前，瑞典等發(fā)達(dá)國家主要使用間接免疫過氧化物酶(IPX)對 PI 動(dòng)物進(jìn)行檢測。有學(xué)者對220份牛血清分別使用 IPX 和 Erns-ELISA 進(jìn)行檢測，兩種檢測方法均能夠很好的檢出陽性樣本，并且大部分樣本的校正光密度(COD，COD= 樣本 OD450nm- 陰性對照OD450nm)值之間具有良好的分離性。其中只有一個(gè)陽性樣本，通過IPX 檢測 COD 值接近臨界值。由此推測，PI 動(dòng)物中病毒滴度主要在102.2TCID50/mL～106TCID50/mL，而感染初期病毒滴度主要維持在100.9TCID50/mL，則判斷該樣本屬于感染初期病牛，體內(nèi)病毒滴度較低，從而證明ELISA 檢測方法靈敏度要高于 IPX 檢測[9]。另一方面，雖然 PI 動(dòng)物體內(nèi)的病毒滴度普遍較高，但存在個(gè)別PI 動(dòng)物病毒滴度低于理論值范圍。因此，該血清樣品也可能來源于PI 動(dòng)物，但病毒滴度較低，接近ELISA 檢測極限，而IPX 檢測則難以區(qū)分。此外也有研究表明，兩種檢測方法會(huì)受到PI 小牛體內(nèi)母源抗體的干擾。有研究分別對4份存在母源抗體的PI 小牛血清進(jìn)行IPX和ELISA 檢測，結(jié)果表明ELISA 受被動(dòng)免疫干擾較少[10]。此外，有實(shí)驗(yàn)證明 ELISA 的性能不受血清熱失活影響，即使運(yùn)輸過程中經(jīng)歷高溫，或?qū)嶒?yàn)室常規(guī)熱滅活，仍能夠良好檢出。

起初診斷性ELISA 試劑盒需要病毒侵染細(xì)胞后，提取細(xì)胞培養(yǎng)物作為ELISA 檢測抗原，成本昂貴，靈敏度低，特異性差。近年來 ELISA 檢測主要使用重組蛋白包被，通過原核或真核表達(dá)出具有抗原性的重組蛋白，顯著降低經(jīng)濟(jì)成本，也顯示出較高的靈敏度和特異性。且使用原核表達(dá)成本更低，表達(dá)量更多。目前已有國外學(xué)者使用Erns蛋白包被，一抗孵育條件 37 min 2 h，對 BVDV 進(jìn)行檢測，具有良好檢測效果[11-12]。此外，國內(nèi)也有學(xué)者使用BVDV 滅活濃縮后作為ELISA 包被抗原，一抗孵育條件 37 min 1 h，檢測 BVDV 特異性抗體，成本高反應(yīng)時(shí)間長[13]。與其相比，本研究利用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)重組Erns蛋白作為抗原，成本低表達(dá)量高；通過對封閉液、樣本稀釋液及稀釋倍數(shù)3 個(gè)影響因素的調(diào)節(jié)，使一抗、二抗的孵育時(shí)間均為30 min，可大大縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率；此外根據(jù)對酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊恼{(diào)節(jié)，1∶10 000 酶標(biāo)二抗的使用量，即可降低檢測成本，還降低了陰性樣本OD450nm值，使其普遍低于0.2，陽性樣本COD 值分離性良好，陰/ 陽性樣本顯色差異顯著。因此，該 ELISA 檢測法操作簡單、成本低，更適用于規(guī)模化的生產(chǎn)和大批量樣本的檢測。

新疆作為我國畜牧大省，已有研究發(fā)現(xiàn)有不同基因型BVDV 的存在。本研究通過對新疆石河子、沙灣、塔城等地區(qū)5 個(gè)牛場(其中2 個(gè)為散戶牛場，3 個(gè)為規(guī)?；?的564份牛血清樣本利用建立的方法進(jìn)行抗體檢測，結(jié)果表明以上地區(qū)規(guī)?；鯞VDV 感染較為嚴(yán)重，并且規(guī)?；隹贵w陽性率是散戶牛場6 倍之多，與報(bào)道相符[1]，能夠較好的檢測出該地區(qū)BVDV 抗體。

本研究建立的基于Erns抗原的BVDV 間接ELISA 檢測方法為我國養(yǎng)牛業(yè)的BVDV 的血清流行病學(xué)調(diào)查和養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。