雞毒支原體GroEL蛋白通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)DF-1細胞釋放IL-1β的研究

張 琳，陳 瑩，朱可蒙，趙雅芝，潘 巧，郝文君，于 穎*，辛九慶*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)是引起雞慢性呼吸道疾病的病原體，在國內(nèi)外養(yǎng)禽場中廣泛流行。MG 感染機體后，可入侵禽類腦組織造成運動障礙，使受感染機體生產(chǎn)性能下降，體重減輕[1]，同時造成T 淋巴細胞和B 淋巴細胞增殖異常，導(dǎo)致免疫抑制，從而使機體對其它病原，如：大腸桿菌、禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒等病原的易感性增加，引起繼發(fā)感染，導(dǎo)致更為嚴重的呼吸道綜合征，增加養(yǎng)殖業(yè)損失[2]。

MG 主要粘附和定植在呼吸道上皮細胞和淋巴組織等部位，誘發(fā)嚴重的組織損傷和炎性反應(yīng)。支原體的膜表面存在大量的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(Lipid-associated membrane proteins，LAMPs)，LAMPs 刺激宿主細胞激活NF-κB 信號通路，促進細胞因子的上調(diào)表達[3]，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本實驗室前期研究顯示 GroEL 蛋白是 LAMPs組分之一，在真核生物中被稱為熱休克蛋白60(Heat shock protein 60，HSP60)[4]。HSP 又稱應(yīng)激蛋白，是機體在高溫、缺氧等外界條件刺激下高效表達的蛋白質(zhì)。在細菌中GroEL 蛋白作為分子伴侶與其輔助蛋白GroES 共同幫助細菌內(nèi)多種蛋白完成裝配，使其具有完整的功能。在應(yīng)急狀態(tài)下，GroEL 過表達或異位表達，均能夠誘發(fā)機體的保護性免疫應(yīng)答，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[5-7]。

鑒于MG GroEL 是 LAMPs組分之一，GroEL 蛋白能否通過NF-κB 信號通路促進細胞因子的上調(diào)表達？ 為此，本研究采用原核表達系統(tǒng)表達了MG 的GroEL 蛋白，通過激光共聚焦試驗、SYBR Green I熒光定量 PCR方法、western blot 等檢測方法對GroEL 蛋白展開研究，為揭示GroEL 蛋白的生物學(xué)功能及闡明MG 的致病機制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及載體 MG R 株、pGEX-6p-1 載體、pEGFP-p65 質(zhì)粒、雞胚胎成纖維細胞(DF-1)均為本實驗室保存；DH5α 感受態(tài)細胞和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑 Q5 DNA 聚合酶和T4 連接酶購自NEB 公司；DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo 公司；Glutathione SepharoseTM4B 購自 GE 公司；膜蛋白提取試劑盒購自Novagen 公司；BAY 11-7082(NF-κB 抑制劑)、BCA定量試劑盒、細胞膜紅色熒光探針DiI 均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔FITC-IgG、細胞核熒光染料 DAPI 購自Sigma 公司；IRDye 680RD山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 抗體購自LI-COR Bioscience 公司；SYBR Green Master、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Roche 公司；GST 抗體和 p65 磷酸化抗體購自CST 公司；GroEL 蛋白的單克隆抗體(MAb)(3G9)由本實驗室制備。

1.3 目的基因擴增及重組質(zhì)粒構(gòu)建 按照DNA 提取試劑盒的說明書提取MG R 株基因組，并以其為模板，根據(jù) GroEL 基因序列(NM_001012916)分別設(shè)計引物(5'-CGCGGATCCATGGCAAAAGAATTAACA TTTGAACA-3'/5'-CGCGTCGACTTATAGGTGATTTA AGCTTGGTTTTTC-3')進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ/SalⅠ雙酶切后克隆至pGEX-6p-1 載體中構(gòu)建原核重組表達質(zhì)粒pGEX-GroEL 并測序鑒定。

1.4 重組蛋白的表達與純化 將重組質(zhì)粒pGEXGroEL轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，重組菌37 ℃180r/min 搖菌至OD600nm0.6 時，加入終濃度為0.1mmol/L IPTG，22 ℃ 180 r/min 誘導(dǎo) 6 h 后離心收集菌體，超聲破碎離心后，將上清液利用GST-resin 純化，純化的重組GST-GroEL 蛋白經(jīng)超濾去除咪唑后，應(yīng)用BCA 定量試劑盒測定純化蛋白的含量。

1.5 重組蛋白的鑒定 將表達的GST-GroEL 蛋白經(jīng) SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至 NC 膜，經(jīng) 5 %的脫脂乳封閉后，以GroEL MAb 3G9 (1∶1000)為一抗，IRDye 680RD 山羊抗鼠 IgG (1∶10 000)為二抗，進行western blot 鑒定。

1.6 GST-GroEL 蛋白粘附DF-1 細胞的檢測 將1 μg GST-GroEL 蛋白與 DF-1 孵育細胞過夜后，利用4%多聚甲醛室溫固定30 min，5%的脫脂乳37 ℃封閉 2 h，以抗 GST 抗體(1∶100)作為一抗，山羊抗兔 FITC-IgG (1∶500)為二抗，并用 DiI 和 DAPI 分別對細胞膜和細胞核染色，利用激光共聚焦顯微鏡觀察重組蛋白粘附情況。同時設(shè)立GST 蛋白作為對照組。

1.7 GST-GroEL 蛋白刺激 DF-1 細胞后 IL-1β 轉(zhuǎn)錄水平的檢測 分別用 0、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL GST-GroEL 蛋白刺激 6 孔板中的 DF-1 單層細胞，12 h 后，收集細胞，采用 SYBR Green I 熒光定量 PCR 檢測 IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平[3]。IL-1β 上游引物：5'-AACATCGCCACCTACAAG-3'；下游引物：5'-GACGGTAATGAAACATAAACG-3'。GADPH 上游引 物 ：5'-ATTCTACACACGGACACTTCA-3'下游引物：5'-CACCAGTGGACTCCACAACATA-3'。

1.8 激光共聚焦檢測 p65 轉(zhuǎn)核 將 2 μg pEGFP-p65 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 DF-1 細胞，轉(zhuǎn)染 24 h 后，采用 1.7篩選出的最佳劑量的 GST-GroEL 刺激 DF-1 細胞6 h，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1% TritonX-100透膜 30 min，5 %的脫脂乳 37 ℃封閉 2 h，DAPI 染核。利用激光共聚焦顯微鏡觀察p65 入核。

1.9 GST-GroEL 蛋白誘導(dǎo)DF-1 細胞p65 磷酸化的檢測 將DF-1 細胞鋪于六孔板中培養(yǎng)至密度為80%左右，利用1μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL GST-GroEL 蛋白刺激DF-1 細胞。12 h 后裂解細胞、獲取總蛋白，SDS-PAGE 電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印于NC膜上，經(jīng) 5 %的脫脂乳 37 ℃封閉2 h 后，以抗 p65(1∶1 000)抗體作為一抗，IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG(1∶10 000)為二抗，同時以 GST 刺激的 DF-I 細胞作為對照，利用western blot 檢測p65 磷酸化水平。

1.10 抑制NF-κB 信號通路后檢測IL-1β 釋放 將DF-1 細胞鋪于12 孔板中培養(yǎng)至密度為80 %左右，分別設(shè)對照組，GST-GroEL 刺激組(GST-GroEL)，抑制劑組(BAY 11-7082)，抑制后刺激組(BAY 11-7082+GST-GroEL)，每組設(shè) 3 孔。對照組不做任何處理；GST-GroEL 刺激組為每孔加入2 μg GST-GroEL 蛋白；抑制劑組為每孔加入終濃度為 5 μmol/L 的 BAY 11-7082；抑制后刺激組為加入終濃度5 μmol/ LBAY 11-7082 培養(yǎng) 2 h 后，加入 2 μg 的 GST-GroEL 蛋白。各組繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后收集細胞，采用SYBR Green I熒光定量PCR檢測IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴增及重組質(zhì)粒構(gòu)建 以MG 基因組為模板，PCR 擴增獲得全長約為 1600 bp 的目的基因，其大小與預(yù)期相符(圖1)。將該片段利用BamHⅠ/SalⅠ雙酶切后克隆于pGEX-6p-1 載體中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-GroEL 并測序鑒定。測序結(jié)果顯示，插入的GroEL 基因序列與MG R 株GroEL 堿基序列一致性為100 %，表明重組質(zhì)粒 pGEX-GroEL 正確構(gòu)建。

圖1 PCR擴增GroEL基因Fig.1 Amplication of the GroEL gene by PCR

2.2 重組蛋白的表達、純化及鑒定 將重組質(zhì)粒pGEX-GroEL 轉(zhuǎn)化至 BL21(DE3)感受態(tài)細胞，選取單菌落經(jīng)PCR 鑒定陽性后誘導(dǎo)表達并純化，SDSPAGE 結(jié)果顯示，重組蛋白GST-GroEL 在大腸桿菌中得到了表達，大小為86 ku，與預(yù)期相符(圖2A)。Western blot 鑒定結(jié)果顯示，在86 ku 處可見特異性反應(yīng)條帶(圖2B)，表明 GST-GroEL 獲得了正確表達，且其有較好的反應(yīng)原性。

圖2 重組蛋白的表達純化及鑒定Fig.2 Anaylsis of purified GST-GroEL protein by SDS-PAGE (A)and western blot (B)

2.3 GST-GroEL 蛋白對DF-1 細胞粘附特性的檢測結(jié)果 將 GST-GroEL 蛋白與 DF-1 細胞孵育后，利用激光共聚焦試驗檢測，結(jié)果顯示，實驗組細胞膜表面出現(xiàn)明顯的綠色熒光，對照組中未見綠色熒光(圖3)。表明 GST-GroEL 蛋白能夠粘附至 DF-1 細胞表面。

圖3 GroEL蛋白對DF-1細胞粘附的檢測結(jié)果Fig.3 The adhesion of GroEL protein to DF-1 cells

2.4 GST-GroEL 蛋白刺激 DF-1 細胞 IL-1β 轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果 分別以不同濃度GST-GroEL 蛋白刺激DF-1 細胞，利用熒光定量PCR 檢測DF-1 細胞中IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，2 μg/mL GSTGroEL 蛋白刺激 DF-1 細胞時，IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平最高(p＜0.01)(圖4)。表明GST-GroEL可以誘導(dǎo)DF-1細胞 IL-1β 的釋放，且 2 μg/mL 為 GST-GroEL蛋白最佳劑量。

圖4 GST-GroEL蛋白刺激DF-1細胞對其IL-1β轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測Fig.4 Transcription of IL-1β induced with different concentrations of GST-GroEL detected by real-time PCR

2.5 激光共聚焦檢測p65 轉(zhuǎn)核的結(jié)果將2μg pEGFP-p65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細胞后，以 2 μg/mL GST-GroEL 刺激DF-1 細胞6 h 后利用激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，實驗組細胞核內(nèi)可見綠色熒光 (圖5)。表明GST-GroEL能夠促進DF-1細胞中pEGFP-p65 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞核。

2.6 GST-GroEL 蛋白誘導(dǎo)DF-1 細胞 p65 磷酸化的檢測結(jié)果 分別以不同濃度的GST 和GST-GroEL蛋白刺激DF-1 細胞，western blot 檢測 p65 磷酸化水平，結(jié)果顯示，在 1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL 的GST-GroEL 蛋白刺激下，實驗組p65 磷酸化水平均明顯高于對照組(圖6)。表明 GST-GroEL 蛋白能夠促進DF-1 細胞中p65 磷酸化水平升高。

圖5 激光共聚焦試驗觀察GroEL蛋白刺激DF-1后p65的入核Fig.5 The observation of p65 nuclear translocation under the laser-scanning confocal microscope

圖6 Western blot驗證GST-GroEL蛋白對DF-1細胞p65磷酸化的促進作用Fig.6 The level of p-p65 induced with GST-GroEL detected by western blot

2.7 抑制NF-κB 信號通路后IL-1β 轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果 收集各組DF-1 細胞，利用熒光定量PCR檢測 DF-1 細胞中 IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，對照組和抑制劑組IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平基本未變化，而抑制后刺激組(BAY 11-7082+GSTGroEL) IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著低于 GST-GroEL刺激組(圖7)。表明 GST-GroEL 蛋白能夠通過NF-κB 信號通路誘導(dǎo) DF-1 細胞釋放 IL-1β。

圖7 NF-κB信號通路對DF-1細胞分泌IL-1β影響的檢測Fig.7 NF-κB signaling pathway impact on the transcription of IL-1β in DF-1 cell detected by real-time PCR

3 討 論

支原體粘附于宿主細胞表面是引起其致病的前提條件[8]。MG 主要粘附和定植在呼吸道上皮細胞、淋巴組織等部位，并誘發(fā)嚴重的組織損傷和炎性反應(yīng)[9]。MG 通過 LAMPs 來粘附和感染宿主細胞，誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答并釋放相應(yīng)細胞因子[10]。在 MG 的研究中，氣管上皮細胞和 DF-1 細胞常被作為細胞模型。由于制備的氣管上皮細胞在體外不能連續(xù)傳代培養(yǎng)，不能滿足實驗需要，因此本研究沒有選擇氣管上皮細胞；而DF-1 為雞成纖維細胞系，是一種可穩(wěn)定傳代、無腫瘤基因、能夠無限增殖的細胞系，已被廣泛應(yīng)用于雞相關(guān)疾病的研究[11]，因此本實驗選用DF-1 細胞作為細胞模型。目前已發(fā)現(xiàn)多個 MG 粘附因子[12-13]。本研究通過激光共聚焦試驗顯示GST-GroEL 能夠粘附于DF-1 細胞表面，結(jié)果表明GroEL 是MG 中一個新發(fā)現(xiàn)的粘附因子。

本研究顯示GroEL 蛋白不僅可以作為粘附分子，還具有上調(diào) IL-1β表達的能力。IL-1β 是重要的炎性因子，參與機體免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細胞凋亡及直接殺傷靶細胞等[14]。研究表明 IL-1β 主要由 NF-κB信號通路調(diào)控產(chǎn)生[15]。NF-κB家族由p50、p52、p65、c-Rel 和 RelB組成，這 5 個家族成員均具有 N端 Rel 同源結(jié)構(gòu)域(Rel homology domain, RHD)[16]。NF-κB 常以二聚體的形式存在，最常見的二聚體結(jié)構(gòu)為p65/p50。p65 含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，參與轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)，具有轉(zhuǎn)錄激活功能，也是研究最多的經(jīng)典信號通路中的細胞因子；而 p52、c-Rel 和 RelB則是非經(jīng)典NF-κB 信號通路中的細胞因子。因此本研究選擇p65 分子進行研究[15]。當(dāng)細胞在靜息狀態(tài)時，NF-κB 與 IκB(Inhibition of κB)結(jié)合組成一個三聚體 p50/p65/IkB，由于 IkB 的存在阻礙了 p50/p65復(fù)合物形成，核定位信號被掩蓋使NF-κB 的活性喪失。當(dāng)細胞受到病原微生物刺激時，IκB 從三聚體中解離出來，使二聚體表現(xiàn)出NF-kB 活性，發(fā)生磷酸化并進入細胞核內(nèi)，啟動下游炎癥相關(guān)的細胞因子和炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[17]。因此 p65 磷酸化或 p65 從胞漿進入細胞核可以作為NF-κB 信號通路被激活的標志。本研究結(jié)果顯示GroEL 蛋白促進了p65 入核并提高了 p65 磷酸化水平，從而激活了 NF-κB 信號通路；當(dāng) NF-κB 信號通路被抑制后，GroEL 蛋白刺激DF-1 細胞產(chǎn)生IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。以上結(jié)果表明GroEL 蛋白具有粘附DF-1 的能力并能夠通過激活 NF-κB 信號通路促進 IL-1β 釋放，從而激活宿主的天然免疫應(yīng)答。

目前，研究許多支原體的 LAMPs 能夠激活NF-κB 信號通路誘導(dǎo) IL-1β 的釋放[18-19]，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答。但是關(guān)于LAMPs 中的哪一種成分能夠激活NF-κB 信號通路研究較少。本研究顯示GroEL 蛋白作為MG LAMPs 中的關(guān)鍵膜蛋白可以粘附到DF-1 細胞表面，直接刺激宿主細胞并促進宿主細胞的p65 磷酸化和入核，啟動了NF-κB 信號通路。本研究從單一組分的角度分析MG 刺激天然免疫的通路，為揭示MG 致病機制的研究提供了參考，對研制基因工程疫苗提供靶標等具有重要價值。