超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肉中尼卡巴嗪殘留標志物

曹愛巧，黃 婷，吳雯娟，羅 燕

（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心， 廣東深圳 518000）

尼卡巴嗪為4,4'-二硝基均二脲（DNC）和2-羥基-4,6二甲嘧啶（HDP）的復(fù)合物，是一種養(yǎng)禽業(yè)常用的性能優(yōu)良、廣譜、高效抗球蟲藥，對球蟲第二代裂殖體有效，推薦劑量下，不會影響雞對球蟲產(chǎn)生免疫力，但應(yīng)在高溫季節(jié)慎用，產(chǎn)蛋期禁用[1]。HDP在動物體內(nèi)由尿液排出，代謝迅速。而DNC通過糞便排出，代謝緩慢[2-4]，不能完全代謝而排除體外，因而在肌肉及其他組織中會出現(xiàn)不同程度的殘留，人們食用該食物后會產(chǎn)生潛在危害[5-7]。 聯(lián)合國糧農(nóng)組織以及新西蘭、日本和我國等均以DNC單體作為尼卡巴嗪的殘留標識物[8]。為規(guī)范尼卡巴嗪在養(yǎng)殖雞群中的用藥，很多國家規(guī)定了雞肉中的尼卡巴嗪殘留標識物和最高殘留限量（MRL）[9]。我國原農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布了235號公告，規(guī)定了雞肉中的尼卡巴嗪MRL為200 μg/kg[10]。目前尼卡巴嗪的檢測方法有氣相色譜法、微柱高效液相色譜法、高效液相法、差示脈沖極譜法、分光光度計法、免疫色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）[5]。本研究基于UPLC-MS/MS，建立了簡便、快捷、高效的雞肉中尼卡巴嗪殘留標志物DNC檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 在市場中抽取雞胸、雞腿部位的新鮮雞肉，充分絞碎并作勻質(zhì)處理后，-20 ℃避光保存。

1.1.2 儀器與設(shè)備 Triple QuadTM4500質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司；N-EVAP-24型全自動氮吹儀：美國Organomation公司；旋渦混合器：IKA Vortex 3，德國；PL602E型天平：瑞士梅特勒；3-30KS離心機：德國Sigma；Milli-Q Integral 3型超純水儀：法國默克密理博公司；AS系列超聲波清洗機：天津奧特賽斯；Watses PRIME HLB固相萃取柱（6 cc、200 mg）：上海楚定科技。

1.1.3 主要試劑與標準物質(zhì) 乙腈、甲醇、甲酸，均為色譜純；乙腈水提取液：80.0%乙腈水溶液+0.2%甲酸；復(fù)溶液：10%甲醇+90%水+0.09%甲酸；標準物質(zhì)：4,4'-二硝基均二苯脲、4,4'-二硝基均二苯脲-D8，均為德國Dr.Ehrenstorfer標準品。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配置 準確稱取4,4'-二硝基均二苯脲、4,4'-二硝基均二苯脲-D8標準品，用甲醇分別配成約1.00 mg/mL的標準儲備液，-18 ℃冰箱中保存。

1.2.2 試驗操作 稱取樣品2.50 g（精確到0.01 g）置于50 mL離心管中，加入50 μL 100 μg/kg DNC-D8標準工作液和10 mL乙腈水提取液，漩渦混勻5 min，超聲提取5 min， 9 000 r/min離心5 min。取上清液3.5 mL直接過 Watses PRIME HLB固相萃取柱（6 cc、200 mg），保持1滴/s速度，收集濾液；準確移出2.5 mL濾液至15 mL帶刻度離心管內(nèi)，40 ℃水浴氮吹至濾液少于0.5 mL；用復(fù)溶液定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 高效液相色譜條件 使用ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱，流動相A相為0.1%甲酸水溶液，流動相B相為甲醇溶液，柱溫為40 ℃，進樣量為5.0 μL。梯度洗脫條件見表 1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源、負離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）、-4 500 V電噴霧電壓、600 ℃離子源溫度、30 psi氣簾氣壓力、8 psi碰撞氣壓力、60 psi霧化氣壓力、65 psi輔助加熱氣壓力。DNC的質(zhì)譜參數(shù)見表 2，空白基質(zhì)及添加藥物樣本色譜圖分別見圖 1、圖2。

表2 DNC的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 DNC空白基質(zhì)添加1.00 μg/kg的色譜圖

圖2 DNC-D8空白基質(zhì)添加5.00 μg/kg的色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

經(jīng)1.2.2試驗方法處理獲得5個樣品空白提取液；用樣品空白提取液配制混合外標濃度分別為2.0、10.0、20.0、200.0、500.0 μg/L的系列標準曲線，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

DNC基質(zhì)試驗的線性范圍在2.0～500.0 μg/L內(nèi)，峰面積與相應(yīng)回收濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y = 0.968 9x+12.354，其相關(guān)系數(shù)為r = 0.999 26，見圖3。

2.2 檢出限確定

取空白雞肉樣本，添加濃度為1.0 μg/kg，按照上述方法進行全過程預(yù)處理，上機測定，平行樣本 n=7，根據(jù)各樣本檢測值，計算出平均值及標準偏差 Sb，再根據(jù)公式檢出限（MDL）=（k×Sb×C）k為置信因子，一般取3）[11]，計算出DNC檢出限為0.11 μg/kg，滿足檢測需求。

2.3 回收率測定

用空白雞肉樣品為基質(zhì)，進行1.0、10.0、200.0 μg/kg 3個水平的陽性添加回收試驗，每個水平取 6個平行樣，按1.2.2中的方法進行處理，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。平均回收率和相對標準偏差結(jié)果（表3）說明：1.0、10.0、200.0 μg/kg 陽性添加回收率范圍分別為91.4%～101.0%、96.0%～98.5%、96.0%～103.0%，均在90%～110%之間，相對標準偏差分別為3.96%、0.92%、2.76%，均小于5%，具有較好的精密度和準確度，滿足檢測要求。

圖3 DNC空白基質(zhì)加標曲線譜圖

表3 DNC的加標樣品回收率及相對標準偏差

3 結(jié)論

本方法采取超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以DNC-D8為內(nèi)標，建立了雞肉中尼卡巴嗪殘留標志物DNC的測定方法。經(jīng)優(yōu)化試驗驗證，一系列濃度的標準樣本溶液（2.0、10.0、20.0、200.0、500.0 μg/L）的標準曲線相關(guān)系數(shù)為r=0.999 26，方法檢出限均為0.11 μg/kg。加標回收試驗的DNC 加標濃度分別為 1.0、10.0、200.0 μg/kg，回收率范圍為91.4%～103.0%，相對標準偏差為0.92%～3.96%，同時進行多批次的實際樣品檢測，均能滿足獸藥殘留分析的相關(guān)要求。本研究建立的方法具有簡便快捷、專屬性強、靈敏度高等特點，相關(guān)參數(shù)優(yōu)化較佳，可準確對樣品進行定性和定量檢測，適用于可食動物肌肉中尼卡巴嗪殘留標志物DNC的檢測。