一種基于重組截短Gcaa407～614蛋白的赤羽病病毒抗體間接ELISA方法的建立

王建華，趙 丹，陳本龍，張俊哲，王玉玲，肖 妍

（天津海關，天津 300456）

赤羽病是由赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）引起的牛、綿羊和山羊等動物的一種通過吸血蚊和庫蠓等傳播的蟲媒傳染病，臨床上以流產、早產，產死胎、木乃伊以及胎兒畸形、新生胎兒關節(jié)彎曲和積水性無腦綜合征為特征[1]。本病主要在非洲以及澳大利亞、日本和韓國等一些熱帶和亞熱帶地區(qū)流行[2-5]。20世紀90年代以來，我國上海、天津和新疆等地均有本病的報道[6-7]。該病給流行國家及地區(qū)的牛、羊養(yǎng)殖業(yè)造成了一定經濟損失。隨著全球性氣溫變暖，本病流行的范圍和時間呈擴大和延長趨勢，對我國牛、羊養(yǎng)殖業(yè)的威脅不容忽視。在病毒學分類上，AKAV屬于布尼病毒科（Buny aviridae）布尼病毒屬辛布（Simbu）病毒血清群成員，為單股負鏈RNA 病毒。其基因組由大（L）、中（M）、?。⊿）3個RNA 片段構成，其中M RNA 編碼1個由1 401個氨基酸組成的M蛋白前體。該前體進一步裂解為Gn 和Gc囊膜糖蛋白和1個非結構Nsm蛋白[8-9]。研究證實，AKAV Gc蛋白為由869個氨基酸組成的囊膜蛋白，不僅參與病毒粒子對宿主細胞的侵入、裝配和成熟過程，也可刺激動物機體產生中和抗體[10-12]，提示該蛋白可作為檢測AKAV抗體的候選抗原之一。針對AKAV血清抗體的檢測，目前國內外已建立了瓊脂凝膠免疫擴散試驗、血凝抑制試驗和微量血清中和試驗（SNT）。這些方法特異性較好，但敏感性較低。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）結合儀器設備特別適合大量血清樣本的抗體檢測，是當前國內外多數動物疫病血清抗體檢測的首選方法和研發(fā)重點。目前僅有IDvet等少數幾家外國公司研制出商品化的AKAV抗體ELISA檢測試劑盒。國內對進境奶牛的赤羽病檢疫仍嚴重依賴國外生產的抗體檢測試劑盒，且來源受限，檢疫成本高。因此，開展這方面的研究工作，對于提升我國赤羽病檢疫與防制能力具有重要的實際意義。本研究基于重組截短Gcaa407～614蛋白建立了一種AKAV抗體間接ELISA檢測方法，并進行了特異性、敏感性、準確性和重復性等試驗，為進一步研制AKAV抗體ELISA檢測試劑盒提供了依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、參考血清和主要試劑

宿主菌E.coli. BL21（DE3）：Biomed公司產品；牛白血病陽性血清、牛傳染性支氣管炎陽性血清、牛藍舌病陽性血清、牛病毒性腹瀉-黏膜病陽性血清、IDvet Screen Akabane Compitition試劑盒：ID.vet公司產品；山羊抗AKAV陽性血清：用純化的AKAV抗原免疫山羊制備的抗血清，由昆明海關檢驗檢疫技術中心艾軍博士饋贈；AKAV陽性牛血清、陰性牛血清：采自經IDvet Screen Akabane Compitition試劑盒和微量血清中和試驗檢測結果分別為強陽性和陰性牛的血清，由天津海關動植物與食品檢測中心反芻動物檢疫實驗室保存；HRP標記的兔抗山羊二抗、山羊抗牛二抗：JACKSON 公司產品；氨芐青霉素、IPTG和Ni2+-NTA Agarose：GIAGEN 公 司 產 品；BugBuster?Master Mix和Immobilon-PSQPVDF膜：MERCK公司產品；DAB顯色試劑盒：碧云天生物技術公司產品。

1.2 AKAV Gc蛋白抗原表位區(qū)預測和主要抗原區(qū)原核表達載體的構建

使用IEDB數據庫（Immune Epitope Database，http∶//www.iedb.org/）的在線分析軟件Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0，對AKAV Gc蛋白（GenBank：BAG54921.1）進行線性抗原表位區(qū)預測分析，選取包含Gc蛋白主要線性抗原表位區(qū)域的編碼序列，送由上海捷瑞生物技術公司經密碼子優(yōu)化后進行人工合成，以BamHⅠ/SalⅠ位點連接到原核表達載體pET-32a（+），構建重組表達載體，命名為 PET-32a（+）-Gcaa407～614，通過測序證實插入的表達序列是否正確。

1.3 重組蛋白誘導表達

將重組表達載體 PET-32a（+）-Gcaa407～614轉化的E.coli BL21（DE3）工程菌擴大培養(yǎng)，按1%的比例接種于含Amp（終濃度為50 μg/mL）的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm＝0.6時，加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，37 ℃誘導培養(yǎng)6 h，離心收集菌液；按5 mL/g濕菌比例，加入細菌裂解液BugBuster?Master Mix，混勻，作用10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，分別收集菌體的裂解液、上清和沉淀，加入等量2×Loading Buffer，沸水水浴5 min；按常規(guī)方法進行SDSPAGE，分析重組蛋白的表達情況。

1.4 重組蛋白純化與復性

用500 mL新鮮LB培養(yǎng)液按1.3的條件誘導培養(yǎng)重組菌，6 000 r/min 離心5 min，收集菌體，用0. 1 mol/L、pH7.5的PBS液洗滌菌體1次，6 000 r/min 離心5 min，收集菌體，然后按5 mL/g 濕菌比例，加入細菌裂解液BugBuster?Master Mix，混勻，冰浴10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，加入20 mL含2%脫氧膽酸鈉的包涵體洗滌液，室溫振蕩洗滌30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，棄上清，用8 mol/L尿素溶解包涵體沉淀。將包涵體溶解液移入裝有Ni+-NTA樹脂的重力柱，在室溫條件下結合1 h，用40 mmol/L咪唑濃度的洗滌液（8 mol/L尿素、50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、40 mmol/L咪唑，PH8.0）洗滌3次，每次10 min，最后用300 mmol/L咪唑濃度的洗脫液（8 mol/L尿素、50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑，PH8.0）洗脫重組蛋白。將純化的重組蛋白trGcaa407～614轉入透析袋中，在4 ℃、緩慢磁力攪拌條件下，放入0. 1 mol/L PBS液（pH7.5）中透析，每隔12 h更換1次透析液，共3次。用IMPLEN超微量分光光度計測定重組蛋白濃度，用SDS-PAGE分析重組蛋白trGcaa407～614的純度，-20 ℃分裝保存。

1.5 重組蛋白抗原性鑒定

將純化的trGcaa407～614經SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜上，用Quickblok TM封閉液封閉過夜，洗滌；一抗為1∶50稀釋的山羊抗AKAV陽性血清，37 ℃ 孵育1 h，洗滌；二抗為1∶5 000稀釋的HRP標記的兔抗山羊二抗IgG，37 ℃ 孵育1 h，洗滌；使用DAB試劑盒顯色，拍照。

1.6 間接ELISA方法建立

1.6.1 抗原最佳包被濃度及抗體最適稀釋倍數確定 用0.05 mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液，將純化的 trGcaa407～614作 0.5、1.0、2.0、4.0 和 8.0 μg/mL 5個稀釋，包被酶標板，100 μL/孔；將AKAV陽性牛血清和陰性牛血清分別用抗體稀釋液倍比稀釋（體積比分別為 1∶40、1∶80、1∶160、1∶320）后加入酶標板，100 μL/孔；按常規(guī)間接 ELISA法操作，以方陣法進行試驗，選擇P/N（陽性血清OD450nm/陰性血清OD450nm）最大，且P在1.0左右的抗原包被濃度和血清稀釋倍數作為抗原最佳包被濃度和抗體最適稀釋倍數。

1.6.2 最佳封閉液確定 分別選擇1.0%明膠、5%小牛血清、5%馬血清、5%兔血清和2% BSA作為封閉液，封閉2 h，用陰、陽性血清按照前述ELISA步驟和判斷方法進行試驗，選擇最佳封閉液。

1.6.3 酶標抗體最佳工作濃度確定 將HRP標記的山羊抗牛IgG-HRP二抗分別作1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000 的倍比稀釋，加入酶標板，100 μL/孔，用陰、陽性血清按照前述ELISA步驟和判斷方法進行試驗，選擇最佳酶標二抗工作濃度。

1.6.4 陰陽性臨界值判定標準確定 取32份經IDvet Screen Akabane Compitition試劑盒和微量血清中和試驗檢測結果為陰性的牛血清，按優(yōu)化后的間接ELISA法進行檢測。將32份陰性血清的平均OD450nm值和3倍標準方差之和（X+3SD）作為陰性樣品值的上限，則待檢血清樣品的OD450nm值大于該上限時判定為陽性，反之為陰性。

1.6.5 特異性試驗 對牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）陽性血清、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）陽性血清、牛白血病病毒（BLV）陽性血清和藍舌病病毒（BTV）陽性血清以及陰性血清，按優(yōu)化后的間接ELISA 法進行檢測，考察該方法的特異性。

1.6.6 敏感性試驗 將AKAV陽性牛血清分別做 1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶3 200的倍比稀釋，按優(yōu)化后的間接ELISA 法進行檢測，考察該方法的敏感性。

1.6.7 重復性試驗 以同一批次制備的純化trGcaa407～614作為包被抗原，按優(yōu)化的間接ELISA 法分別檢測3份血清樣品，每份樣品重復3孔，考察該方法的批內重復性；另以不同批次制備的純化trGcaa407～614作為包被抗原，按優(yōu)化的間接ELISA 法分別檢測3份血清樣品，每份樣品重復3孔，考察該方法的批間重復性。

1.7 臨床樣本檢測

選取273份本實驗室保存的2015—2018年來自澳大利亞進口奶牛的血清樣本（這些樣本預先經IDvet Screen Akabane Compitition試劑盒和微量血清中和試驗檢測），用本研究建立的間接ELISA法進行AKAV抗體檢測，并與這兩種方法的檢測結果進行比較。

2 結果

2.1 Gc蛋白主要抗原區(qū)預測及重組表達載體構建

對AKAV Gc蛋白主要線性抗原表位區(qū)域的預測結果見表1。由表1可知，在Gc蛋白中可能存在3個主要線性抗原表位區(qū)域（Val247—Gln376、Arg380—Gly576和 Cys635—Gly810），分別由130、197和176個氨基酸組成，選取基本涵蓋Gc蛋白第2個主要線性抗原表位區(qū)域的Gln407—Gly614氨基酸編碼序列作為表達序列，對該序列經密碼子優(yōu)化后進行人工基因合成，與原核表達載體pET-32a（+）連接，構建重組表達載體PET-32a（+）-Gcaa407～614，經測序證實所合成的基因序列及其編碼氨基酸序列完全正確，具體見圖1。

圖1 人工合成的DNA序列及編碼的氨基酸序列

2.2 重組蛋白誘導表達及純化

SDS-PAGE結果顯示，在37 ℃、1 mmol/L的IPTG誘導后6 h，含有原核表達載體PET-32a（+）-Gcaa407～614的重組菌裂解液在約46 kD處出現特殊的蛋白條帶，與預期的重組蛋白分子量一致，而未誘導的重組表達菌裂解液中缺失此蛋白條帶，用凝膠成像儀蛋白條帶分析軟件測得該重組蛋白的表達量約占菌體總蛋白的30%左右，進一步分析表明表達的重組蛋白以包涵體形式表達。對用8 mol/L尿素變性的包涵體采用Ni+2-NTA樹脂的重力柱洗脫法進行純化，選取20～80 mmoL/L咪唑濃度分別進行洗滌。試驗結果顯示，用40 mmoL/L咪唑濃度的洗滌液洗滌雜蛋白，獲得了純度和濃度分別為94%和2.4 mg/mL的重組蛋白，取得較好的純化效果，命名為 trGcaa407～614，見圖 2。

表1 AKAV Gc蛋白線性抗原表位區(qū)域預測結果

圖2 重組蛋白trGcaa407～614的表達和純化的SDS-PAGE分析

2.3 重組蛋白Western blot鑒定

以山羊抗AKAV陽性血清對純化的重組蛋白進行Western blot檢測，發(fā)現在約46 kD處出現1條清晰的特異性反應條帶（圖3），表明重組蛋白trGcaa407～614可被山羊抗AKAV陽性血清識別。

圖 3 重組蛋白 trGcaa407～614 的 Western blot分析

2.4 間接ELISA方法的建立

2.4.1 抗原最佳包被濃度及抗體最適稀釋倍數確定 結果如表2所示，當抗原包被濃度為4.0 μg/mL時，血清濃度為1∶80，此時P/N值最大（8.59），陽性血清 OD450nm≥1。因此，抗原最佳包被濃度為4.0 μg/mL，血清最適稀釋倍數為1∶80。

2.4.2 最佳封閉液的確定 結果如表3所示，封閉液選擇1.0%明膠時，P/N值最大且陽性血清≥1.0，陰性血清OD450nm＜0.3。

表2 最適抗原包被濃度和血清稀釋度確定

表3 不同封閉液條件下AKAV陰、陽性血清檢測結果（OD450 nm）

表4 酶標抗體最佳工作濃度確定

2.4.3 酶標抗體最佳工作濃度確定 結果如表4所示，當酶標二抗選擇1∶5 000濃度時，P/N值最大且陽性血清OD450nm≥1.0，陰性血清OD450nm＜0.3。

2.4.4 陰陽性臨界值判定標準確定 結果如表5所示，32 份陰性樣品的平均OD450nm值為 0.207，SD值為0.037，陰性樣品值的上限X+3SD＝0.207+3×0.037＝0.318。因此，當待檢血清樣品的OD450nm值大于0.318時判定為陽性，小于或等于0.318時判定為陰性。

2.4.5 特異性試驗 結果如圖4所示，僅有AKAV陽性血清的檢測結果為陽性，而IBRV、BVDV、BLV和BTV的陽性血清檢測結果為陰性，表明該trGcaa407～614-ELISA方法具有良好的特異性。

2.4.6 敏感性試驗 結果如圖5所示，當血清做1∶1 280 稀釋時，OD450nm值高于0.318，表明該trGcaa407～614-ELISA 方法對 1∶1 280 稀釋的 AKAV 陽性血清仍可檢出陽性。

圖4 特異性試驗結果

2.4.7 重復性試驗 結果如表6所示，3份血清樣品的批內重復試驗和批間重復試驗的變異系數均低于10%，表明該trGcaa407～614-ELISA方法具有良好的重復性。

表5 AKAV陰性血清檢測結果

表6 重復性試驗結果

圖5 敏感性試驗結果

2.5 臨床樣本檢測

用本研究建立的間接ELISA法對273份血清樣本進行抗體檢測，發(fā)現在11份經IDvet Screen Akabane Compitition試劑盒檢測為陽性的牛血清中，8份 為 SNT檢 測 陽 性，10份 為 trGcaa407～614-ELISA檢測陽性（表7），trGcaa407～614-ELISA方法與SNT和IDvet Screen Akabane Compitition試劑盒檢測的陽性符合率分別為80.0%（8/10）和90.9%（10/11）。

3 討論

近年來我國在AKAV抗體ELISA檢測方法的研究方面取得了一些進展，但仍然處于試驗和評價階段。已報道的AKAV抗體ELISA檢測方法多采用純化的全病毒抗原或表達的重組核蛋白抗原為包被抗原[12-14]，由于辛波病毒群S基因序列同源性很高，其編碼的N蛋白是群特異性抗原，易與同群的病毒感染產生的抗體發(fā)生交叉反應，因此基于全病毒抗原或表達的重組核蛋白抗原建立的AKAV抗體ELISA檢測方法在特異性等方面還存在亟待解決的技術問題。研究發(fā)現，辛布病毒群M基因節(jié)段的序列變異性較大，其編碼Gc蛋白的氨基酸序列同源性僅為33.1%～47.3%，而Gc蛋白在AKAV各分離株之間的同源性卻很高[15-18]，這提示選用Gc蛋白為檢測抗原，可能是提高AKAV血清抗體ELISA檢測方法特異性的有效途徑。與AKAV全抗原制備工藝和成本相比較，利用原核表達系統制備重組Gc蛋白，具有表達量高、生產周期短和成本低的優(yōu)點，在AKAV抗體ELISA檢測試劑盒研發(fā)上具有實際應用價值。為此，本研究基于對AKAV Gc蛋白線性抗原表位區(qū)域的在線預測分析結果，選取Gc蛋白Gln407—Gly614區(qū)域的編碼基因序列，按照大腸桿菌密碼子的偏愛性進行了密碼子優(yōu)化和人工合成，通過構建重組原核表達載體實現了該編碼序列在大腸桿菌中的高效表達。Western blot結 果 顯 示， 重 組 rHis-Gc407aa—614aa蛋白能夠被AKAV陽性血清識別，具有良好的抗原性。本研究利用Ni+2-NTA樹脂親和層析方法，獲得了較高濃度和純度的重組蛋白trGcaa407～614，并以該純化的重組蛋白建立了間接ELISA方法。試驗結果表明，該ELISA方法檢測AKAV抗體具有較好的特異性、敏感性和重復性。SNT試驗是確定AKAV抗體陽性血清的標準方法，其對273份血清樣本的AKAV抗體檢測結果表明，本研究建立的間接ELISA法的檢出率略高于SNT方法，但低于商品化的IDvet Screen Akabane Compitition試劑盒，提示本研究建立的間接ELISA法有待于進一步改進和完善。為此，在后續(xù)研究工作中，將以重組蛋白trGcaa407～614為抗原制備特異性單克隆抗體，建立基于trGcaa407～614及其單克隆阿抗體的阻斷ELISA方法，從而更好地保證AKAV抗體ELISA檢測方法的特異性。

表7 trGcaa407-614-ELISA對273份血清樣本的檢測結果