藍(lán)舌病病毒血清I型VP2與VP5、VP3與VP7兩組蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)與鑒定

李占鴻，楊 恒，宋子昂，高 林，李華春，廖德芳

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，熱帶亞熱帶動物病毒重點實驗室，云南昆明 650224）

藍(lán)舌?。╞luetongue，BT）是由藍(lán)舌病病毒（bluetongue virus，BTV）感染引起的一種嚴(yán)重侵害反芻動物的烈性傳染病。BTV通過庫蠓（Culicoides）對牛、羊、駱駝等反芻動物的吸血性叮咬傳播。綿羊?qū)TV最易感，發(fā)病率可達(dá)70%，病死率可達(dá)40%。發(fā)病綿羊的主要癥狀為高熱、口唇充血腫脹及糜爛、鼻腔和胃腸黏膜出血潰瘍[1]。BT的暴發(fā)和流行給牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報動物疫病[2]。

BTV為呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）的代表成員，其病毒粒子由內(nèi)部核心、內(nèi)層衣殼與外層衣殼3部分組成[3]，其中外層衣殼由Seg-2與Seg-6基因編碼的VP2與VP5蛋白構(gòu)成，氨基酸序列具有高度變異的特性，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，決定著病毒血清型[4]。BTV的內(nèi)層衣殼由Seg-3與Seg-7基因編碼的VP3與VP7蛋白構(gòu)成，氨基酸序列在不同血清型BTV毒株之間高度保守，可誘導(dǎo)BTV群特異性抗體產(chǎn)生[5]。

疫苗接種是防控BT的重要環(huán)節(jié)之一。目前商品化的BTV疫苗包括弱毒疫苗與滅活疫苗兩類[6]。BTV弱毒疫苗存在病毒擴(kuò)散、毒力返強(qiáng)以及與流行野毒株發(fā)生基因重配等風(fēng)險[7-8]；BTV滅活苗雖具有較高的安全性，但存在免疫保護(hù)期短、生產(chǎn)成本高、批間重復(fù)性差等問題[9]。此外，弱毒疫苗和滅活苗都存在難以區(qū)分疫苗免疫和自然感染的問題。因此，進(jìn)一步開發(fā)安全高效且易于區(qū)別自然感染與疫苗免疫的BTV基因工程疫苗成為研究重點[6]。近年來已有關(guān)于BTV的活病毒載體疫苗[10]、DNA疫苗[11]、非感染性單復(fù)制周 期 疫 苗[12]（disabled-infectious-single-cycle，DISC）以及通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的類病毒顆粒（virus-like particles，VLP）亞單位疫苗[5]等報道。

我國存在多種BTV血清型毒株的流行，不同血清型BTV毒株對綿羊的致病性存在較大差異。BTV1型為我國廣泛流行的血清型之一，對綿羊具有較強(qiáng)的致病性[13]，因此開發(fā)安全高效的BTV1型疫苗，對我國BT防控具有重要意義。本實驗室前期成功開發(fā)了BTV1型滅活疫苗，并在綿羊上取得了良好的免疫保護(hù)效果[14]。但BTV1型基因工程疫苗的研究在我國尚屬空白。本研究采用“Bac to Bac”雙啟動子桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，分別構(gòu)建了共表達(dá)BTV1型病毒VP2與VP5蛋白，VP3與VP7蛋白兩種重組桿狀病毒。將重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞，通過免疫熒光（ fluorescence immunoassay，IFA）和Western-blot證實，目的蛋白得以表達(dá)且具有良好的反應(yīng)原性，這為進(jìn)一步開發(fā)針對我國BTV1型的VLP亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞、質(zhì)粒與抗體

BTV1型毒株（YNDH/V013/2014）、野生型桿狀病毒、Sf9昆蟲細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞：均由本實驗室保存；大腸桿菌Stable3感受態(tài)細(xì)胞：購自北京博邁德公司；大腸桿菌DHB10感受態(tài)細(xì)胞、桿狀病毒雙啟動子表達(dá)質(zhì)粒pFastBacDual：購自Invitrogen 公司；BTV1/V013毒株Seg-2、Seg-3、Seg-6、Seg-7全長序列克隆質(zhì)粒PLB-BTV1/V013/Seg-2、PLB-BTV1/V013/Seg-3、PLB-BTV1/V013/Seg-6與PLB-BTV1/V013/Seg-7：由本實驗室構(gòu)建保存。

鼠源抗BTV VP7蛋白單克隆抗體：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈；兔抗BTV1型VP2、VP3與VP5蛋白多克隆抗體：由本實驗室以大腸桿菌表達(dá)的BTV1型病毒VP2、VP3與VP5蛋白免疫家兔制備；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG：購自碧云天生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

高保真DNA聚合酶Q5 High-Fidelity、DNA Polymerase與限制性內(nèi)切酶：購自NEB公司；Protein Marker、DNA Marker、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等：購自寶生物工程（大連）有限公司；Easy Geno重組克隆試劑盒、RIPA高效組織細(xì)胞裂解液、HRPDAB底物顯色試劑：購自北京天根生物技術(shù)公司；Cellfectin II Reagent轉(zhuǎn)染試劑以及Grace's、Sf900 II培養(yǎng)基：購自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)前期獲取BTV1型毒株YNDH/V013/2014全基因組序列設(shè)計引物，用于擴(kuò)增該毒株的Seg-2、Seg-3、Seg-6與Seg-7的ORF區(qū)。采用重組克隆方式進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建，登錄天根公司無縫克隆引物在線設(shè)計工具（http∶//123.56.75.195/）分別輸入待克隆目的基因與pFastBacDual載體質(zhì)粒序列，選擇單酶切線性化質(zhì)粒載體，獲取引物序列（表1），引物由上海捷瑞生物公司合成。

表1 BTV1型毒株YNDH/V013/2014的Seg-2、-3、-6與-7基因節(jié)段ORF區(qū)擴(kuò)增引物

1.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.4.1 重組質(zhì)粒pBac-BTV1-VP5與pBac-BTV1-VP7構(gòu)建 分別以BTV1/V013毒株的Seg-6與Seg-7 全長序列克隆質(zhì)粒PLB-BTV1/V013/Seg-6與PLB-BTV1/V013/Seg-7為模板，使用BTV1-VP5-F/R、BTV1-VP7-F/R引 物， 采 用Q5 High-Fidelity DNA Polymerase擴(kuò)增BTV1/V013毒株Seg-6與Seg-7的ORF區(qū)。提取pFastBacDual質(zhì)粒，使用XhoI內(nèi)切酶（酶切位點位于質(zhì)粒pP10啟動子下游）進(jìn)行質(zhì)粒的酶切線性化。PCR產(chǎn)物與酶切質(zhì)粒經(jīng)電泳膠回收后，使用Easy Geno重組克隆試劑盒按說明書將Seg-6與Seg-7 ORF區(qū)DNA克隆至線性化pFastBacDual質(zhì)粒，挑取白色菌落進(jìn)行PCR鑒定；將PCR陽性菌進(jìn)行測序驗證，對測序正確的質(zhì)粒分別命名為pBac-BTV1-VP5與pBac-BTV1-VP7。

1.4.2 重組質(zhì)粒pBac-BTV1-VP2/VP5與pBac-BTV1-VP3/VP7構(gòu)建 分別以BTV1/V013毒株的Seg-2與Seg-3 全長序列克隆質(zhì)粒PLB-BTV1/V013/Seg-2與PLB-BTV1/V013/Seg-3為模板，使用BTV1-VP2-F/R、BTV1-VP3-F/R引物，PCR擴(kuò)增BTV1/V013毒株Seg-2與Seg-3的ORF區(qū)。提取pBac-BTV1-VP5與pBac-BTV1-VP7重組質(zhì)粒，使用PstI（酶切位點位于質(zhì)粒pPH啟動子下游）對質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化，用Easy Geno重組克隆試劑盒將Seg-2與Seg-3的ORF區(qū)，分別克隆到pBac-BTV1-VP5與pBac-BTV1-VP7重組質(zhì)粒的pPH啟動子下游，構(gòu)建出共表達(dá)BTV1型病毒的VP2與VP5蛋白、VP3與VP7蛋白的重組質(zhì)粒pBac-BTV1-VP2/VP5與 pBac-BTV1-VP3/VP7，將重組質(zhì)粒進(jìn)行測序確認(rèn)。

1.5 重組桿狀病毒DNA獲取

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBac-BTV1-VP2/VP5與pBac-BTV1-VP3/VP7與空載體質(zhì)粒pFastBacDual分別轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂布含卡那霉素 （50 μg/mL）、慶大霉素（7 μg/mL）、四 環(huán) 素（10 μg/mL）、 X-gal（100 μg/mL）與IPTG（40 μg/mL）的LB平板，30 ℃避光培養(yǎng)24～36 h，挑選白色菌落進(jìn)行PCR鑒定。將PCR鑒定陽性菌在LB液體培養(yǎng)基中增菌，采用堿裂解法提取重組桿狀病毒DNA，獲取的桿狀病毒DNA命名為Bac-BTV1-VP2/VP5、Bac-BTV1-VP3/VP7與pFastBacDual。

1.6 Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染與重組桿狀病毒獲取

將生長狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞均勻接種6孔板細(xì)胞板，每孔細(xì)胞密度為1.6×106個/mL，將細(xì)胞置于28 ℃培養(yǎng)2 h后，吸棄SF900-II培養(yǎng)基，使用無血清的Grace's 培養(yǎng)基將細(xì)胞輕輕潤洗1次；取1 μg桿狀病毒DNA，使用Cellfectin II Reagent轉(zhuǎn)染試劑按說明書轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，同時設(shè)立空白轉(zhuǎn)染對照；將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6～7 d，當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變（cytopathogenic effects，CPE）后，離心收集細(xì)胞上清，接種 Sf9細(xì)胞，連續(xù)盲傳2代；收集第3代細(xì)胞培養(yǎng)物，使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取核酸，進(jìn)行BTV Seg-2與 Seg-7的PCR擴(kuò)增鑒定。

1.7 間接免疫熒光檢測重組桿狀病毒表達(dá)VP5與VP7蛋白

取P3代 培 養(yǎng) 的Bac-BTV1-VP2/VP5、Bac-BTV1-VP3/VP7重組桿狀病毒與野生型桿狀病毒感染12孔板培養(yǎng)的Sf9 細(xì)胞，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，用-20 ℃ 預(yù)冷的甲醛∶丙酮（1∶1）固定液，室溫下固定20 min；使用含5%（m/v）脫脂奶粉的PBST于37 ℃封閉1.5 h；棄封閉液，分別加兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗體（1∶500稀釋）與鼠抗BTV1-VP7蛋白單克隆抗體（1∶4 000稀釋），37 ℃ 孵育1 h；以PBST洗滌3次（5 min/次）后，分別加入1∶2 000稀釋的FITC 標(biāo)記山羊抗兔 IgG和 1∶1 500稀釋的FITC 標(biāo)記山羊抗鼠 IgG，37 ℃條件下避光孵育30 min；PBST洗滌5次（5 min/次）后，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光產(chǎn)生情況。

1.8 Western-blot檢測重組桿狀病毒表達(dá)VP2與VP3蛋白

取 P3代 Bac-BTV1-VP2/VP5、Bac-BTV1-VP3/VP7重組桿狀病毒與野生型桿狀病毒，分別感染6孔板Sf9細(xì)胞，于28 ℃培養(yǎng)3 d，離心收集細(xì)胞，加入200 μL的RIPA組織細(xì)胞裂解液，冰浴靜置10 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）；用含 5%（m/v）脫脂奶粉溶液的 PBST于37 ℃封閉2 h后，分別加入1∶500稀釋的兔抗BTV1-VP2與兔抗BTV1-VP3多克隆抗體，37 ℃孵育1 h；以PBST洗滌3次（10 min/次）后，加入1∶1 000稀釋的HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育45 min；用PBST洗滌3次（10 min/次），加入DAB底物顯色試劑顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔）曝光，觀察目的蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增與重組質(zhì)粒構(gòu)建

BTV1型毒株YNDH/V013/2014的Seg-2、Seg-3、Seg-6與Seg-7的ORF區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得2.9、2.7、1.6與1 kb的特異性DNA條帶（圖1）。將BTV1型病毒的Seg-2或Seg-3插入桿狀病毒雙啟動子pFastBacDual質(zhì)粒載體的pPH啟動子下游，將BTV1型病毒的Seg-6或Seg-7插入pFastBacDual質(zhì)粒載體pP10啟動子下游，構(gòu)建出共表達(dá)BTV VP2與VP5、VP3與VP7蛋白的重組質(zhì)粒pBac-BTV1-VP2/VP5與pBac-BTV1-VP3/VP7（圖2）。對重組質(zhì)粒的測序結(jié)果顯示，插入的序列與前期獲取的序列相似度為100%，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組桿狀病毒獲取以及在Sf9細(xì)胞上引起的CPE

提取重組桿狀病毒DNA，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后的6 d未觀察到明顯的CPE。取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清在Sf9細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)盲傳，在盲傳的第3代觀察到感染病毒后的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞逐漸融合、崩解，部分細(xì)胞脫落（圖3）。提取細(xì)胞核酸，使用本實驗室開發(fā)的BTV1的Seg-2血清型特異性引物與BTV的Seg-7群特異性擴(kuò)增引物，可分別擴(kuò)增出大小約1.6 kb與1 kb的DNA條帶，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示為BTV1型毒株YNDH/V013/2014的Seg-2與Seg-7序列，表明獲取了具有感染性重組桿狀病毒。

2.4 重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞中表達(dá)VP5與VP7蛋白檢測

圖 1 BTV1型毒株Seg-2、Seg-3、Seg-6與Seg-7的ORF區(qū)擴(kuò)增以及獲取的Bac-BTV1-VP2/VP5、Bac-BTV1-VP3/VP7重組桿狀病毒DNA

圖2 pBac-BTV1-VP2/VP5與pBac-BTV1-VP3/VP7質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

圖3 重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7感染的Sf9細(xì)胞引起的CPE（100倍）

通過免疫熒光檢測重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7感 染的Sf9細(xì)胞中VP5與VP7蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖4顯示：使用抗BTV VP5蛋白抗體進(jìn)行染色的Sf9細(xì)胞（感染Bac-BTV1-VP2/VP5）和使用抗VP7抗體進(jìn)行染色的Sf9細(xì)胞（感染Bac-BTV1-VP3/VP7）均顯示了強(qiáng)烈的綠色熒光，而野生型桿狀病毒（未插入任何目的基因）感染的Sf9細(xì)胞未見任何特異性的熒光產(chǎn)生。結(jié)果表明，重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7感染的Sf9細(xì)胞可分別高效表達(dá)VP5蛋白與VP7蛋白。

圖4 重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7感染的Sf9細(xì)胞中VP5與VP7蛋白的免疫熒光檢測（100倍）

2.5 重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞中表達(dá)VP2與VP3蛋白檢測

收獲重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7感染的Sf9細(xì)胞，分別用兔抗BTV1病毒VP2蛋白多克隆抗體和兔抗BTV1病毒VP3蛋白多克隆抗體進(jìn)行Western-blot檢測。結(jié)果顯示：重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7感染的Sf9細(xì)胞均可檢測到大小約100 kD的特異性蛋白條帶（圖5），與預(yù)測的BTV1型YNDH/V013/ 2014毒株的VP2蛋白（112 kD）VP3蛋白（103 kD）大小基本一致；野生型桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中，在對應(yīng)位置未檢測到特異性蛋白條帶出現(xiàn)。Western-blot的結(jié)果表明，重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7成功表達(dá)出BTV1型的VP2與VP3蛋白。

3 討論

圖5 Western-blot檢測重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7感染Sf9細(xì)胞后VP2蛋白（A）與VP3蛋白（B）的表達(dá)

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，在病毒亞單位疫苗研究方面具有特殊的優(yōu)勢：（1）通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白可在昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確的折疊，并完成翻譯后的修飾加工，產(chǎn)生類病毒顆粒（VLP），可高效誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生體液免疫、細(xì)胞免疫為機(jī)體提供有效的免疫保護(hù)[15-16]；（2）由于VLP只含有特定的病毒蛋白，便于通過抗體檢測區(qū)分疫苗免疫和自然感染動物[16]；（3）桿狀病毒基因組作為表達(dá)載體可以容許多個外源基因的同時高效表達(dá)[17]；（4）桿狀病毒只感染節(jié)肢動物，對脊椎動物無感染性，具有很好的安全性。目前，已有多種利用該系統(tǒng)表達(dá)制備的亞單位疫苗通過批準(zhǔn)上市，如抗豬瘟、豬霍亂、豬圓環(huán)病毒等亞單位疫苗[16-17]。

BTV的VP2蛋白是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體的主要蛋白[4]；VP5蛋白雖然不是激發(fā)特異中和抗體的蛋白，但研究表明VP5蛋白可通過影響VP2蛋白的構(gòu)象從而影響影響VP2抗體的產(chǎn)生[4，18]。因此，本研究同時選擇了BTV1病毒的VP2與VP5蛋白作為候選抗原進(jìn)行桿狀病毒的表達(dá)。VP3與VP7均為BTV的群特異性抗原，含有多個T淋巴細(xì)胞抗原表位，可刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答[5，19]，更為重要的是，研究表明通過在桿狀病毒在Sf9細(xì)胞中表達(dá)VP2與VP5、VP3與VP7兩組蛋白組裝出VLP，只需使用單獨表達(dá)VP2蛋白劑量的百分之一，即可激發(fā)與之相當(dāng)?shù)目贵w水平[20]，這是本研究構(gòu)建共表達(dá)BTV的VP3與VP7蛋白桿狀病毒的重要原因。下一步，將通過重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7共感染Sf9細(xì)胞的方式，進(jìn)行BTV VLP組裝。

由于抗BTV1的VP5與VP7蛋白的抗體具有構(gòu)象依賴性，因此通過免疫熒光檢測重組桿狀病毒Bac-BTV1-VP2/VP5與Bac-BTV1-VP3/VP7感染的Sf9細(xì)胞中BTV1-VP5與BTV1-VP7蛋白的表達(dá)，結(jié)果感染Bac-BTV1-VP2/VP5和Bac-BTV1-VP3/VP7重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞均顯示了強(qiáng)烈的綠色熒光信號。這一方面證實了BTV1-VP5與BTV1-VP7蛋白在Sf9細(xì)胞中的高效表達(dá)，另一方面也證實了表達(dá)的BTV1-VP5與BTV1-VP7蛋白在Sf9細(xì)胞中形成了正確的構(gòu)象。本實驗室制備的抗BTV1-VP2多克隆抗體與抗BTV1-VP3蛋白多克隆抗體識別的抗原表位為線性表位，因此本研究通過Western blot驗證BTV1-VP2與BTV1-VP3蛋白的表達(dá)。

本研究根據(jù)我國BTV1型流行毒株遺傳信息所構(gòu)建的，分別表達(dá)BTV1-VP2/VP5和BTV1-VP3/VP7的重組桿狀病毒，可在昆蟲細(xì)胞中有效表達(dá)，并具有良好的反應(yīng)原性。接下來將嘗試進(jìn)行BTV1 VLP的組裝、純化等工作，并對BTV1 VLP的免疫保護(hù)效果進(jìn)行驗證，為開發(fā)針對我國BTV1毒株的亞單位疫苗據(jù)奠定一定的基礎(chǔ)。