東北邊境地區(qū)嚙齒動物中新埃立克體感染調(diào)查及groEL基因序列分析

王 卓,王建偉2,于 淼,馮 立,王秀紅,許志偉, 田 圃2，吳益民

新埃立克體(CandidatusNeoehrlichiamikurensis，Nm)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種蜱媒病原體，隸屬立克次體目無形體科新埃立克體屬(CandidatusNeoehrlichia)[1-2]。Nm最早于1999年在荷蘭的篦子硬蜱(Ixodesricinus)中檢測到, 被認(rèn)為是一種類似埃立克體(Ehrlichia-like)的病原體[3]。2004年，日本學(xué)者Kawahara等通過基于16S rRNA基因和groEL基因的系統(tǒng)發(fā)育分析將該病原體歸為無形體科的一個新種，命名為CandidatusNeoehrlichiamikurensis[2]。近年來，歐洲多個國家和地區(qū)以及俄羅斯(遠(yuǎn)東、西伯利亞地區(qū))、日本等地的蜱或嚙齒動物中均有關(guān)于Nm發(fā)現(xiàn)的報道, 表明該病原體呈世界性分布[1-6]。流行病學(xué)調(diào)查研究證實我國一些省份小嚙齒動物存在Nm感染, 并從蜱咬發(fā)熱患者中發(fā)現(xiàn)Nm感染病例[7-8]。

東北地區(qū)是我國重要的蟲媒傳染病自然疫源地，特別是蜱媒傳染病，媒介蜱和動物宿主攜帶病原體種類豐富，如黑龍江立克次體、查菲埃立克體、森腦病毒和伯氏疏螺旋體等[9-11]。為了解Nm自然感染狀況和特點, 本研究在東北地區(qū)的密山、集安和寬甸采集嚙齒動物標(biāo)本，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行Nm感染的病原分子生物學(xué)檢測。

1 材料與方法

1.1鼠標(biāo)本來源 選擇黑龍江省密山縣(2016年)低山丘陵耕地，吉林省集安市、遼寧省寬甸縣(2012年)針闊混交林區(qū)和林緣耕地，采用夾夜法和籠夜法捕獲嚙齒動物。所有嚙齒動物現(xiàn)場分類鑒定, 經(jīng)消毒處理后解剖取其脾臟，置于1.5ml細(xì)胞冷凍管內(nèi)，液氮保存。運回實驗室后置-80 ℃保存。鼠標(biāo)本采集地點見圖1。

圖1 本研究采樣點示意圖Fig.1 Geographic location of collected rodents

1.2鼠脾標(biāo)本DNA提取 剪取約3 mm3脾組織，置于玻璃研磨器中充分研碎，應(yīng)用DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN) 按說明書操作提取DNA，DNA提取液置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴增 用巢式PCR擴增NmgroEL基因(熱休克蛋白基因)，groEL基因引物按文獻(xiàn)[8]設(shè)計，由上海申工生物工程公司合成。Nm的一輪PCR采用外引物Nm-out1 (5′-TGGCAAATGTAGTTGTAACAGG-3′)/Nm-out2(5′-TCTACTTCACTTGAACCGCCA-3′)。擴增條件: 94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性30 s, 53 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 40個循環(huán)后，72 ℃再延伸7 min。擴增產(chǎn)物目的片段大小為1 147 bp;二輪PCR采用內(nèi)引物Nm-in1(5′-CCTATTAGTAAGCCTTATGGTAC-3′)/Nm-in2(5′-GAAGAATTACTATCTACGCTACC-3′)。二輪擴增條件除72 ℃延伸60 s, 35個循環(huán)不同, 其它與一擴相同。最終擴增產(chǎn)物目的片段大小為891 bp。

1.4序列測定及分子遺傳進(jìn)化分析 PCR 陽性產(chǎn)物由上海申工生物技術(shù)公司測序。應(yīng)用Internet網(wǎng)中BLAST操作平臺，將測序結(jié)果與GenBank中注冊的NmgroEL基因序列進(jìn)行比較，采用DNAstar及Mega5.0軟件進(jìn)行同源性分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1嚙齒動物種類與分布 在東北地區(qū)3個調(diào)查點捕獲嚙齒動物共181只，包括6個鼠種，鼠種與分布見表1。黑線姬鼠(Apodemusagrarius)所占比例最高，占70.17%;其次為林姬鼠(Apodemuspeninsulae)、大倉鼠(Tscherskiatriton)和褐家鼠(Rattusnorvegicus), 分別占13.26%、8.29% 和7.18%。小林姬鼠(Apodemussylvaticua)和鼩鼱(Sorexaruneus)較少，分別占0.55%。

2.2嚙齒動物中Nm感染情況 應(yīng)用groEL基因的巢式PCR檢測3地181只野鼠，5只感染Nm, 感染率為2.76%(表1)。其中, 集安(JA)和寬甸(KD)野鼠感染率分別為5.97%(4/67)和1.52%(1/66),密山野鼠未檢出陽性, 3地野鼠Nm感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.3124,P=0.1158)。感染鼠種主要涉及黑線姬鼠(2.36%)和林姬鼠(8.33%), 其它鼠種未檢出陽性。

2.3基因序列比較 經(jīng)序列比對分析，5份NmgroEL基因陽性測序標(biāo)本的基因序列相似性為99.88%～100%。其中，3份黑線姬鼠標(biāo)本(JA4、JA9，KD46)基因序列完全一致, 2份林姬鼠標(biāo)本(JA14、JA23)基因序列基本一致, 與黑線姬鼠標(biāo)本相似性為99.88%。

表1 不同地區(qū)不同鼠種的Nm感染情況

Tab.1 Prevalence ofCandidatusNeoehrlichiamikurensisin rodents from the 3 regions

嚙齒動物種 類樣本數(shù)(%)Nm檢出陽性率(%)寬甸集安密山感染率黑線姬鼠127(70.17)1/49(2.04)2/39(5.13) 0/39(0)3/127(2.36)林姬鼠24(13.26)0/13(0)2/11(18.18)02/24 (8.33)小林姬鼠1(0.55)0/1(0)000/1(0)大倉鼠15(8.29)00/15(0)00/15 (0)褐家鼠13(7.18)0/3(0)0/1(0)0/9(0)0/13 (0)鼩鼱 1(0.55)00/1(0)00/1(0)合計181(100)1/66(1.52) 4/67(5.97)0/48(0)5/181(2.76)

2.4遺傳進(jìn)化分析 選擇GenBank數(shù)據(jù)庫中Nm注冊的核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，并以浣熊新埃立克體(CandidatusNeoehrlichialotoris)、嗜吞噬無形體和查菲埃立克體作為參照。見圖2。進(jìn)化樹分析顯示集安和寬甸的5份鼠標(biāo)本與俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)全溝硬蜱株(FJ966363, FJ966359)及我國黑龍江省蜱株(JQ359077、KC106716)、黑龍江省Nm感染病人株(JQ359062)同處一個分枝，歸類于ClusterⅠ。與歐洲Nm株(ClusterⅡ)、我國西南和東南地區(qū)的Nm株及日本的Nm株(Cluster Ⅲ、Cluster Ⅳ)有較大差異，說明Nm基因型分布與地理來源相關(guān)。

圖2 基于groEL基因部分片段(827 bp)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree ofCandidatus Neoehrlichia mikurensisinferred from 827 bp of thegroELgene sequences

3 討 論

目前，全世界正面臨著新發(fā)傳染病的重大威脅，大部分屬于人獸共患、媒介生物傳播性疾病，而新發(fā)蜱媒病原體(如伯氏疏螺旋體、黑龍江立克次體、嗜吞噬細(xì)胞無形體等)引起的人類疾病即屬于這一范疇。Nm是新發(fā)現(xiàn)的歸屬于無形體科的蜱媒病原體，巳知硬蜱屬(Ixodesspp.)和嚙齒動物分別為其主要的傳播媒介和宿主動物[1-2，4-6]。近年來，在歐洲多個國家和地區(qū),澳大利亞、尼日利亞及我國周邊國家俄羅斯、日本、蒙古等地均有Nm相關(guān)報導(dǎo)[1-8]。北美地區(qū)浣熊中發(fā)現(xiàn)了與Nm進(jìn)化關(guān)系較近的病原體，其命名為CandidatusNeoehrlichialotoris[12]。我國Nm的研究起步較晚，2003年P(guān)an等[13]在廣州褐家鼠(Rattusnorvegicus)脾臟樣本中檢測到的16S rRNA基因與無形體科埃立克體屬(Ehrlichia)有明顯區(qū)別，暫命名為Ehrlichiasp.rattus variant[13]。2012年Li等[8]應(yīng)用PCR進(jìn)行鼠中新埃立克體感染調(diào)查, 我國11個調(diào)查地區(qū)中有7個地區(qū)鼠標(biāo)本Nm檢出陽性，為我國多個地區(qū)可能存在Nm自然疫源地提供了分子流行病學(xué)證據(jù)。目前，世界范圍內(nèi)Nm感染病例報導(dǎo)較少，自2010年發(fā)現(xiàn)第一例感染患者以來僅有報導(dǎo)13例，歐洲散發(fā)病例6例[1，14]，其余7例從我國黑龍江省牡丹江林區(qū)蜱咬發(fā)熱病人發(fā)現(xiàn)[7]。

Burri等人通過動物接種實驗證明嚙齒動物為Nm的動物宿主[16], 在歐洲多個國家的嚙齒動物中均發(fā)現(xiàn)Nm感染，涵蓋6個鼠種, 不同地區(qū)嚙齒動物Nm感染率差異較大, 如德國感染率高達(dá)52.7%, 而法國僅1.8%[1，5]。在亞洲，中國、日本、俄羅斯(西伯利亞和遠(yuǎn)東地區(qū))等多個地區(qū)的嚙齒動物中多個鼠種存在Nm感染[1，8]。本研究對我國東北邊境地區(qū)三個調(diào)查點進(jìn)行捕鼠采樣，通過分子生物學(xué)方法調(diào)查鼠中Nm感染情況，從集安和寬甸黑線姬鼠和林姬鼠檢出Nm5份, 感染率為2.76%(5/181), 說明野鼠可能是該病原體的重要儲存宿主, 調(diào)查地區(qū)可能存在Nm自然疫源地。Li等報導(dǎo)[7-8]，我國不同地區(qū)鼠類Nm感染率為4.0%(1.5%-13.8%), 黑龍江省牡丹江林區(qū)鼠類感染率為3.8%, 本研究結(jié)果(2.76%)與國內(nèi)報導(dǎo)基本一致。以往的研究證明，集安和寬甸的不同鼠種攜帶多種蜱媒病原體,包括斑點熱立克次體、查菲埃立克體、無形體、伯氏疏螺旋體等, 并存在復(fù)合感染[10，15], 本研究從該兩地鼠類檢出了Nm, 說明該地區(qū)存在多種蜱媒傳染病并存的自然疫源地。

無形體科的遺傳進(jìn)化分析主要以groEL基因、rrs基因和gltA基因具有較好的分辨力。Kawahara等采用rrs基因、groEL基因系統(tǒng)發(fā)育分析將Nm歸類為無形體科一個新種[2]。2012年Li等[8]依據(jù)rrs基因、groEL基因系統(tǒng)發(fā)育分析可將Nm分為4種基因型，我國東北地區(qū)以及俄羅斯亞洲地區(qū)的Nm基因型為Cluster I, 歐洲的Nm均為Cluster II, 我國西南和東南地區(qū)以及源于日本的Nm分別為Cluster III和Cluster IV(圖2), 顯示出基因型分布與地理來源密切相關(guān)[7]。本研究獲得的NmgroEL基因序列與俄羅斯亞洲地區(qū)以及我國東北地區(qū)已報道的序列一致，屬于ClusterⅠ型。

本次研究結(jié)果表明，調(diào)查地區(qū)嚙齒動物存在Nm感染，感染率為2.76%，基因型別為ClusterⅠ型, 應(yīng)重視Nm對人的潛在威脅。Nm作為一種新發(fā)的對人存在致病性的蜱媒病原體，其流行病學(xué)調(diào)查研究較少，進(jìn)一步開展媒介蜱和嚙齒動物Nm流行病學(xué)研究以及感染病例調(diào)查，為自然疫源地確定及該病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無

本文引用格式：王卓, 王建偉, 于淼, 等. 東北邊境地區(qū)嚙齒動物中新埃立克次體感染調(diào)查及groEL基因序列分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2019,35(4): 330-333. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.032