六種常用漁藥對寬體金線蛭的急性毒性試驗

唐 毅，吳榮華，袁 淵，孫龍龍，唐紅霞，安小平，沈財祥

(1.淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶400715；2.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，重慶 400715；3.重慶多普泰制藥股份有限公司，重慶400800；4.重慶銘實農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司，重慶400800；5.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，300384)

寬體金線蛭(Whitmaniapigra)俗稱螞蟥，屬環(huán)節(jié)動物門蛭綱顎蛭目水蛭科。寬體金線蛭在陸地淡水環(huán)境生長繁殖,主要分布于我國南方地區(qū)的淡水水域中，在北方部分地區(qū)也有少量存在。寬體金線蛭主要應(yīng)用于醫(yī)藥上，是當(dāng)今國內(nèi)外緊俏的醫(yī)用價值較高的名貴中藥材，既可供中藥處方配伍使用，也是許多制藥廠生產(chǎn)的多種中成藥(丸劑和膠囊等)中的重要成分[1]。據(jù)有關(guān)研究結(jié)果顯示，寬體金線蛭的干體和鮮體均含有高抗凝活性物質(zhì)，具有顯著的抗凝活性[2]。主要用于防治心腦血管疾病，并具有較好的抗癌和保健功能。隨著醫(yī)藥行業(yè)對寬體金線蛭需求量的逐年增多，受利益驅(qū)動，人們過度捕捉野生資源現(xiàn)象嚴(yán)重，從而導(dǎo)致自然資源量嚴(yán)重下降，甚至枯竭，因而其價格也隨之成倍增長?；诖?，近幾年來，寬體金線蛭人工集約化養(yǎng)殖發(fā)展較為迅速，隨之而來的有關(guān)病害也在逐年增多[3]，人們采用多種藥物對病害進(jìn)行防治，但因?qū)λ幬锏姆N類選擇或用法用量不當(dāng)，甚至濫用等，導(dǎo)致寬體金線蛭大量死亡。為了更好地了解寬體金線蛭對常用漁藥的敏感性，實驗選擇二氧化氯、高錳酸鉀、苯扎溴銨、戊二醛、伊維菌素和聚維酮碘作為研究對象，進(jìn)行寬體金線蛭幼蛭的急性毒性試驗，以期探討對寬體金線蛭的用藥劑量，為寬體金線蛭的自然保護(hù)和疾病防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗水蛭

試驗水蛭來自重慶銘實農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司水蛭養(yǎng)殖基地人工繁殖培育的寬體金線蛭幼蛭。隨機(jī)選取規(guī)格相近，無病無傷、體質(zhì)健壯的個體(平均體質(zhì)量為(0.11±0.05)g/條)作為試驗對象。試驗前將寬體金線蛭置于塑料箱中暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)期間，每天換新水量占總水體的10%左右。

1.2 試驗條件

試驗在西南大學(xué)水產(chǎn)創(chuàng)新實驗室進(jìn)行。試驗所用容器為50 L的長方形塑料箱，箱內(nèi)放置用于防止水蛭外逃的篩絹網(wǎng)袋，并加入10 L經(jīng)曝氣24 h以上的自來水作為試驗用水，其pH為6.5～7.0，溶解氧7.0～8.5 mg/L，水溫26.5～28.5 ℃。為減少光照對水蛭的影響，試驗在室內(nèi)弱光條件下進(jìn)行。

1.3 試驗藥品

二氧化氯：含40 %穩(wěn)定性白色粉末二氧化氯(山西運城益康藥業(yè)有限公司)；苯扎溴銨：含1.1%苯扎溴銨，淺黃色液體(山西運城益康藥業(yè)有限公司)；聚維酮碘：含10 %聚維酮碘(運城春蕾藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，紅棕色晶狀粉末；高錳酸鉀：分析純，含99.9 %高錳酸鉀(成都市科龍化工試劑廠)，紅褐色晶體；伊維菌素：含0.4 %伊維菌素(成都市科龍化工試劑廠)，白色晶狀粉末；戊二醛：含50 %戊二醛(成都市科龍化工試劑廠)，無色透明油狀液體。

1.4 試驗方法

采用靜水生物毒性試驗法進(jìn)行試驗[4-5]。為排除殘餌糞便對實驗結(jié)果的影響,試驗期間不投餌，每天測定水溫。試驗分為預(yù)試驗和正式試驗。預(yù)試驗以取得24 h使水蛭全致死的最低質(zhì)量濃度值及96 h無死亡的最高質(zhì)量濃度值，并根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定出各試驗藥物濃度區(qū)間，然后按等對數(shù)間距設(shè)置5個濃度梯度組(表1)和1個空白組，每組設(shè)2個平行，每個平行隨機(jī)放15條水蛭。試驗前先用蒸餾水將試驗藥物配成母液，再根據(jù)各試驗濃度梯度組的質(zhì)量濃度吸取母液加入試驗容器中，配成所需濃度的試驗藥液，藥液現(xiàn)配現(xiàn)用。對具有較大揮發(fā)性的二氧化氯藥物，在試驗開始后每隔24 h更換1次試驗液，以保證試驗藥物的濃度及藥效，其余5種藥品均不更換。藥液配好后，將裝有15條水蛭的篩絹網(wǎng)袋，放入試驗箱并使其淹沒試驗液中。試驗開始后連續(xù)8 h觀察并記錄水蛭的活動狀況、中毒癥狀、死亡情況等，之后每8 h觀測一次,并記錄各質(zhì)量濃度組水蛭24、48、72、96 h的死亡數(shù)和存活數(shù)，對死亡的水蛭及時撈除，放入曝氣24 h的清水中。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為水蛭卷曲、蛭體僵硬，5 min內(nèi)多次針刺無任何反應(yīng)則判定為死亡。

表1 試驗藥物及其濃度

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用改良寇氏法( Karber)計算半致死濃度(LC50)[6]，依據(jù) Turubell公式計算安全濃度(SC)[7-8]。

2 結(jié)果

6種漁藥對寬體金線蛭幼體急性毒性試驗結(jié)果見表2。

表2 6種常用漁藥對寬體金線蛭幼體急性毒性試驗結(jié)果

通過6種漁藥對寬體金線蛭幼蛭的急性毒性試驗，結(jié)果表明(表2)，當(dāng)二氧化氯濃度最低(5.600 mg/L)時，30 h后水蛭出現(xiàn)明顯中毒癥狀，身體變軟，反應(yīng)遲鈍，40 h開始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)15%左右；濃度為最高(13.44 mg/L)時，2 h開始出現(xiàn)死亡，72 h死亡率達(dá)到100%。當(dāng)高錳酸鉀濃度最低(1.6 mg/L)時，50 h后水蛭出現(xiàn)身體變形和亂晃癥狀，82 h開始出現(xiàn)死亡，死亡水蛭體表黏液增多，吸盤變白變腫，96 h死亡率約7%；濃度為最高(5.000 mg/L)時，4 h開始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)到100 %。當(dāng)苯扎溴銨濃度最低(0.001 mg/L)時，58 h后水蛭身體中后部出現(xiàn)較明顯腫脹，96 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；濃度為最高(0.010 mg/L)時，4h開始出現(xiàn)死亡，72 h死亡率達(dá)到100%。當(dāng)戊二醛濃度最低(0.036 mg/L)時，42 h后水蛭出現(xiàn)吸盤腫脹、活力減弱癥狀，56 h開始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)7%左右；濃度為最高(0.120 mg/L)時，10 h開始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)到70%左右。當(dāng)伊維菌素濃度為最低(0.002 mg/L)時，90 h后水蛭出現(xiàn)身體變形、蜷縮癥狀，96 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；濃度為最高(0.020 mg/L)時，9 h開始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)到90%左右。當(dāng)聚維酮碘濃度為最低(1.800 mg/L)時，42 h后水蛭出現(xiàn)身體變形、蜷縮癥狀，68 h開始出現(xiàn)死亡，死亡水蛭體表黏液增多，96 h死亡率為5%左右；濃度為最高(5.600 mg/L)時，8 h開始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)到100%。6種漁藥對寬體金線蛭的96 h半致死濃度最低者為伊維菌素(0.001 6 mg/L)，最高者為二氧化氯(8.627 8 mg/L)。安全質(zhì)量濃度(LC)最高者為二氧化氯(1.559 3 mg/L)，最低者為伊維菌素(0.000 2mg/L)，其從大到小依次為：二氧化氯﹥聚維酮碘﹥高錳酸鉀﹥戊二醛﹥苯扎溴銨﹥伊維菌素。

3 討論

6種藥物對寬體金線蛭急性毒性試驗結(jié)果表明，寬體金線蛭在各個時間段內(nèi)的死亡率和對藥物的半致死濃度隨藥液濃度大小與作用時間長短的不同，即藥物濃度的大小和作用時間的長短影響受試生物的死亡率及存活情況。由表2可知，二氧化氯等6種藥物對寬體金線蛭幼蛭的半致死濃度(LC50)值隨試驗時間的延長而減小，表明該6種藥物對寬體金線蛭的毒性作用隨時間的增加而增強(qiáng)，因此藥物的毒性具有累加效應(yīng)。

在24～72 h內(nèi)，二氧化氯對寬體金線蛭的半致死濃度(LC50)值由17.972 1 mg/L降低到8.924 8 mg/L，即隨試驗時間的延長LC50存在著顯著變化；在72～96 h內(nèi)，隨著時間的延長半致死濃度(LC50)值(8.9248～8.6278 mg/L)則沒有明顯變化。結(jié)果表明,在24～48 h內(nèi)寬體金線蛭對二氧化氯藥物具有一定的抗藥性，但當(dāng)試驗時間從48 h增加到72 h時抗藥性則逐漸降低。

高錳酸鉀、聚維酮碘、戊二醛、苯扎溴銨、伊維菌素等5種藥在24～48 h內(nèi)，對寬體金線蛭的半致死濃度(LC50)值隨試驗時間的延長存在著顯著變化；但當(dāng)試驗時間從48 h增加到96 h時，隨著時間的延長半致死濃度(LC50)值則沒有明顯的變化，表明在48 h之前寬體金線蛭對以上藥物具有一定的抗藥性，但隨著時間的延長抗藥性則逐漸減弱。

各試驗時間段半致死濃度(LC50)值由高至低依次為：二氧化氯>聚維酮碘>高錳酸鉀>戊二醛>苯扎溴銨>伊維菌素。6種藥物對寬體金線蛭的96 h LC50分別為8.627 8、3.453 8、2.813 8、0.072 9、0.003 2、0.001 6 mg/L，屬于一般毒性至高毒性藥物；安全濃度(SC)分別為1.559 3、0.676 9、0.478 1、0.006 8、0.000 3和0.000 2 mg/L。其中，高錳酸鉀對寬體金線蛭的安全濃度與對菲牛蛭的安全濃度(0.54 mg/L)相近[9]。結(jié)果表明,6種漁藥對寬體金線蛭的毒性強(qiáng)弱依次為,伊維菌素>苯扎溴銨>戊二醛>高錳酸鉀>聚維酮碘>二氧化氯。

4 結(jié)論

(1)二氧化氯對寬體金線蛭的96 h LC50為8.627 8 mg/L，安全濃度(SC)為1.559 3 mg/L，安全性較高，在其養(yǎng)殖過程中可安全使用。

(2)高錳酸鉀對寬體金線蛭的96 h LC50為2.813 8 mg/L，安全濃度(SC)為 0.478 1 mg/L，安全性較低，在其養(yǎng)殖過程中需慎用。

(3)聚維酮碘對寬體金線蛭的96 h LC50為3.453 8 mg/L，安全濃度(SC)為0.676 9 mg/L，安全性較高，在其養(yǎng)殖過程中可安全使用。

(4)戊二醛對寬體金線蛭幼蛭的96 h LC50為0.072 9 mg/L，安全濃度(SC)為0.006 8 mg/L，為高毒藥物，因此在其疾病防治中應(yīng)慎用。

(5)苯扎溴銨對寬體金線蛭幼蛭的96 h LC50為0.003 2 mg/L，安全濃度(SC)為0.000 3 mg/L，為高毒藥物，在其疾病防治中應(yīng)慎用。

(6)伊維菌素對寬體金線蛭幼蛭的96 h LC50為0.001 6 mg/L，安全濃度(SC)為0.000 2 mg/L，為高毒藥物，在其疾病防治中應(yīng)慎用。