三氯生對雄性斑馬魚鰓組織凋亡相關基因表達的影響

劉海芳，王 凡，姚衛(wèi)云

(1.中原工學院，鄭州 450007；2.洛陽師范學院，河南洛陽 471022)

三氯生(triclosan，TCS)，又名三氯新，被廣泛應用于各類醫(yī)療用品和生活日用消費用品中[1-2]。由于TCS的大量使用使其在各個環(huán)境介質中普遍存在，其主要通過污水廠出水排放進入水體和土壤中。目前，已在污水處理廠進出水、污泥、河流、河口、沉積物及生物體中檢測到TCS的存在，且其在污水處理廠進出口水區(qū)域的最高濃度可達27 μg/L[3]?，F已證實，TCS具有生物蓄積性、穩(wěn)定性和多種其他生物毒性。因此，關于TCS環(huán)境行為、生態(tài)毒理、健康安全評價等研究已經引起廣泛關注。

近年來許多學者已經報道了TCS的生物毒效應。劉飛等[4]研究證實TCS對紅白鯽具有潛在的遺傳毒性，且隨著在TCS暴露濃度的增加，其毒性效應也隨之而增強。危玲等[5]的綜述表明TCS是一種影響生殖的內分泌干擾物。陳建軍等[6]研究發(fā)現TCS具有顯著的生理毒性，能夠抑制泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)肝組織中的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性。Alice等[7]發(fā)現TCS能夠降低魚類孵卵率以及延長孵化時間，對魚類產生顯著的繁殖和發(fā)育影響。迄今為止，對于硬骨魚類TCS分子生物毒性的研究相對較少，尤其在魚類凋亡相關基因的表達影響方面。

斑馬魚(DanioRerio)是一種實驗室常用的模式動物，它與人類基因高度相似，經常被應用到毒理學和藥理學的研究中。鰓作為魚類最重要的呼吸器官，可直接反映水體污染物對魚體的毒害程度，通常作為魚類毒性效應研究的主要靶器官之一[8]。因此，本研究以斑馬魚為研究對象，利用PCR技術探討不同濃度的TCS對于斑馬魚鰓組織促進和抑制細胞凋亡相關基因表達的影響，其主要目的是揭示TCS對于鰓組織損傷的相關分子機制，同時也為TCS對人類健康提供安全性評價提供支撐材料。

1 材料和方法

1.1 研究對象

試驗用魚購自上海誠信漁場，體長為1.5～2.1 cm，暫養(yǎng)于實驗室玻璃水族箱中馴化7 d，每日定時投喂餌料兩次，吸出餌料殘渣、排泄物等，每日用曝氣72 h的自來水更換養(yǎng)殖用水，水溫(22±3)℃，pH值6.9±0.2，24 h不斷充氧，并確保溶氧量>5 mg/L。然后取大小相似、行為迅速敏捷、健康狀況良好的斑馬魚分組進行試驗。

1.2 試驗試劑

三氯生(美國Sigma公司)、總RNA極速提取試劑盒(上海飛捷生物技術有限公司)、RNA反轉錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)、2×Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)、GoldView I型核酸染色劑、Bestar SybrGreen qPCR mastermix(德國DBI公司)、二甲基亞砜溶劑(天津紫明化工有限公司)、基因引物(華大基因公司)、瓊脂糖、Loading buffer染料等。

1.3 實驗設計

查閱相關文獻得知TCS對斑馬魚96 h LC50為340 μg/L[9]。在此基礎上，設置1/20 LC50(17 μg/ L)、1/10 LC50(34 μg/L)、1/5 LC50(68 μg/L)3個TCS處理組(低于安全濃度、安全濃度、高于安全濃度)，并設置空白對照組，每組同時設置兩個平行。隨機選擇暫養(yǎng)后的斑馬魚幼魚100尾放置于每一濃度組水族箱中，每個水族箱用水量20 L，以半靜態(tài)水體暴露法對斑馬魚進行連續(xù)處理42 d。整個試驗期間其他條件同暫養(yǎng)期間。

1.4 樣本的制備

TCS處理42 d后，選出行動敏捷、生長狀況良好、體表健康的斑馬魚進行解剖。每個濃度斑馬魚均分為五組，并且每組取出5條雄性斑馬魚鰓組織的混合樣作為一個樣本。然后迅速轉移并保存在超低溫冰箱中用于后期凋亡相關基因表達的檢測。

1.5 凋亡相關基因表達的檢測

1.5.1 引物序列

Bcl-2、Bax、p53、MDM2、β-actin(內參)基因的引物序列來自于相關報道[9-10]，詳見表1。

表1 PCR所用基因的特異性引物及其序列

1.5.2 RNA的提取與反轉錄

按照總RNA 極速抽提試劑盒提供的方法，提取每個雄性斑馬魚的鰓組織混合樣。對提取出的RNA用凝膠電泳分析其質量，并用超微量分光光度計檢測其純度和濃度。對質量好、濃度適宜、純度高的RNA樣本進行反轉錄反應。

1.5.3 普通PCR

將反轉錄得到的cDNA加入目的基因和內參基因的上下游引物、2×Taq MasterMix及無菌水制備25 μL的普通PCR反應體系。將反應體系充分混勻，根據普通PCR步驟進行擴增反應，其擴增反應條件為94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 2 min。擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳反應，電泳完成后觀察并保存各個基因的表達結果。

1.5.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

為鑒定引物特異性是否符合RT-qPCR實驗的要求，在進行正式RT-qPCR反應之前，用實時熒光定量PCR儀來分析上述引物的特異性。結果顯示，內參基因與各個目的基因融解峰一致，擴增效率都接近100%，這表明所合成的引物可以用于本研究實驗過程中的實時熒光定量PCR反應。為了檢驗是否可用2-ΔΔct法來計算目的基因的相對表達量，對每個基因做標準曲線，結果發(fā)現，各個基因的擴增效率都接近100%，這表明可用2-ΔΔct法來計算mRNA的相對表達量

把反轉錄獲得的cDNA、目的基因和內參基因的上下游引物，Bestar SybrGreen qPCR mastermix以及無菌水，配制20 μL的反應體系進行實時熒光定量PCR反應。反應條件為：95 ℃ 預變性2 min；循環(huán)條件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，同時檢測熒光信號，40個循環(huán)反應；融解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/循環(huán)0.5 ℃/循環(huán))86個循環(huán)。

1.6 數據分析

對RT-qPCR的Cq值利用2-ΔΔt法進行數據處理。應用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結果用平均值±標準差來表示，采用LSD法來分析各個濃度組與空白對照組之間的差異，若P<0.05，則為差異顯著；P<0.01則為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 目的基因和內參基因的普通PCR反應結果

圖1 內參及目的基因在不同濃度組的TCS表達情況

普通PCR結果如圖1所示，通過分析每個TCS濃度組Bcl-2、Bax、p53和MDM2基因與內參基因(β-actin)灰度值之比的大小來比較目的基因的相對表達。Bcl-2在各個TCS濃度組的表達量無明顯變化；p53在各個TCS濃度組的表達量都有下調趨勢，表現差異不明顯；MDM2在各個TCS濃度組表達均有上調趨勢，但差異表現不明顯；Bax在17、34 μg/L的TCS濃度組表達量無明顯變化，但在68 μg/L處理組中表達量有下調趨勢。以上結果表明，普通PCR并不能顯著分析出TCS對斑馬魚鰓凋亡相關基因表達量的影響。

2.2 三氯生對雄性斑馬魚鰓凋亡相關基因表達的實時熒光定量分析

圖2 不同TCS濃度組斑馬魚鰓凋亡相關基因mRNA的表達

為了證實TCS對斑馬魚鰓的各種抗氧化基因的表達量的影響，采用RT-qPCR法并分析處理組的表達與對照之間的差異顯著性。結果如圖2所示，與空白對照組相比，Bcl-2基因在各個TCS濃度處理組表達水平都無顯著差異；Bax基因在不同濃度的TCS濃度組中的表達水平均有下調趨勢，且在68 μg/L TCS濃度組極顯著下調，下調了94.9%；Bcl-2/Bax在17、34 μg/L濃度組中無明顯變化，而在68 μg/L TCS處理組極顯著上升；p53基因在不同濃度的TCS濃度組中的表達水平均具有下調趨勢，其中在68 μg/L濃度下表現為顯著下調，基因表達下調了96.3%；MDM2基因在不同濃度的TCS濃度組中的表達水平均具有上調趨勢，且在34 μg/L和68 μg/L濃度下表現為極顯著上調，其上調幅度分別是空白對照組的6.6倍、10.8倍。

3 討論

Bcl-2與Bax同屬于一個基因家族，在控制細胞凋亡的復雜網絡中作用相反。Bcl-2能夠抑制細胞色素C的釋放，從而起到抑制細胞凋亡的作用[11]。 Bax可以抑制Bcl-2基因的活性，當Bcl-2 與 Bax 形成同源二聚體時，便可誘導凋亡[12-15]，在控制細胞凋亡的復雜網絡中Bcl-2與Bax比例的變化會影響細胞凋亡[16]，當Bcl-2/Bax比值上升和下降會對細胞的凋亡分別起到抑制和促進的作用。在本研究中，Bcl-2與Bax基因在不同濃度處理組中的基因表達都有下調趨勢；Bcl-2與Bax比值在低濃度呈下調趨勢，但在68 μg/L TCS處理組極顯著上調。這表明不同濃度的TCS都能夠干擾細胞凋亡基因的表達，且可能在低濃度TCS處理組促進凋亡，而在68 μg/L處理組中，可能起到抑制細胞凋亡的作用。劉林等[17]研究的納米氧化鋅能夠使斑馬魚肝臟中Bcl-2的表達及Bcl-2/Bax比值下降，表明納米氧化鋅能夠促進斑馬魚肝臟細胞的凋亡；魯疆等[18]的研究發(fā)現CdCl2使斑馬魚胚胎Bcl-2的表達及Bcl-2/Bax比值顯著下降。上述結果有的方面和本研究結果不太一致，可能是由于污染物濃度、種類、暴露時間長短及魚的組織不同所造成的。

p53基因是一種抑癌基因，其編碼產物是核轉錄因子[19]，其主要作用是阻滯細胞周期、促進細胞凋亡。另外 p53基因的表達還涉及到維持基因組穩(wěn)定、細胞自噬、抑制腫瘤血管生成、調節(jié)代謝、影響生殖等其他方面作用[20-22]。MDM2基因是一類癌基因，其蛋白表達產物能夠抑制細胞的凋亡。MDM2基因與p53 基因在基因表達網絡中聯(lián)系緊密。由MDM2基因編碼的MDM2蛋白在細胞內的主要功能是通過調節(jié)p53蛋白的穩(wěn)定性而影響細胞的生長狀態(tài)[23]，當MDM2基因擴增所導致的基因表達過強則可封閉p53介導的激活作用，使p53功能喪失，導致基因不穩(wěn)定及細胞增生，從而抑制細胞的凋亡。在本研究中p53基因在3個TCS處理組中的表達水平均有下調趨勢，并且在68 μg/L處理濃度組中表現出顯著下調；而MDM2基因在三組不同濃度的TCS處理組中的基因表達均有上調趨勢，其34 μg/L和68 μg/L TCS處理濃度組中的基因表達量為極顯著上調。因此，在較高濃度的TCS處理組中，能夠抑制斑馬魚鰓組織的細胞凋亡。該結果也進一步證實了TCS在68 μg/L處理組中，可能起到抑制斑馬魚細胞凋亡的作用。本研究結果表明TCS在斑馬魚安全濃度和高于安全濃度情況下，對鰓凋亡相關基因表達產生顯著影響，而該濃度和污水處理廠進出口水區(qū)域的最高濃度接近，由于TCS具有蓄積的特性，因此，TCS對污水廠進出口區(qū)域生物的分子毒性應該引起重視。

綜上所述，TCS對雄性斑馬魚細胞凋亡有關基因的表達具有一定影響，且在高濃度下，其影響程度更為顯著。由于影響細胞凋亡的基因較多，控制其基因表達的網絡調控較復雜，其調控機制還需更深層次的研究。