基于生物信息學(xué)途徑探索與高原低氧心肌損傷相關(guān)微小RNA

施冰，崔慶華，馮振龍，李俊峽

文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA可參與調(diào)控高原低壓低氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓，通過檢測(cè)循環(huán)miRNA表達(dá)水平，協(xié)助診斷肺動(dòng)脈高壓[1]，提示循環(huán)miRNA可能成為診斷急性高原病的新的生物標(biāo)志物。30%的急性高原病可能發(fā)生心源性猝死。目前有關(guān)miRNA在急性高原低壓低氧相關(guān)心肌損傷的功能及其機(jī)制研究未見報(bào)道。本研究通過低壓氧艙模擬高原低壓低氧環(huán)境，建立高原低氧心肌損傷大鼠模型。應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，篩選與高原低壓低氧心肌損傷相關(guān)的關(guān)鍵miRNA?；谏镄畔W(xué)途徑，分析關(guān)鍵miRNA的功能及其作用機(jī)制。為進(jìn)一步從miRNA層面探索急性高原性心臟病的發(fā)生機(jī)制、早期診斷和干預(yù)策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組選取6周齡SPF級(jí)SD大鼠，體重200±20 g，雄性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審核。采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（低壓低氧暴露3 d、7 d、14 d、28 d）和常壓常氧對(duì)照組，每組12只動(dòng)物。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)用實(shí)驗(yàn)艙（貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司）模擬高原低壓低氧條件。參數(shù)設(shè)定：模擬海拔高度7000 m，升降速度10 m/s，艙內(nèi)壓力39.1 kPa，艙內(nèi)氧氣壓力9.022 kPa。實(shí)驗(yàn)組大鼠置于實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，實(shí)驗(yàn)艙運(yùn)行時(shí)間23 h/d，晝夜比12 h：12 h。對(duì)照組大鼠置于實(shí)驗(yàn)艙外，處理等同于實(shí)驗(yàn)組大鼠。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢查各組大鼠完成實(shí)驗(yàn)當(dāng)日出艙后立刻行超聲心動(dòng)圖檢查。經(jīng)2%丙戊酸鈉溶液腹腔注射麻醉后，大鼠胸前褪毛，仰臥固定。將小動(dòng)物超聲儀的超聲探頭（頻率17.5 MHZ）置于大鼠胸骨前，顯示左室短軸切面。于乳頭肌水平，應(yīng)用M超聲記錄左心室運(yùn)動(dòng)曲線。分別測(cè)量舒張末期左室前壁厚度（LVAWD）、左室后壁厚度（LVPWD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDD）和收縮末期內(nèi)徑（LVIDS），評(píng)估左心室結(jié)構(gòu)。測(cè)量PV峰值速度和PV峰值梯度，評(píng)估左心室舒張功能。計(jì)算左心室短軸縮短率（FS%）和射血分?jǐn)?shù)（EF%），評(píng)估左心室收縮功能。

1.4 心肌組織病理學(xué)檢查大鼠完成超聲心動(dòng)圖檢查后斷頸處死。取出心臟，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分后稱重。10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度4 μm，HE染色，光鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.5 心肌組織miRNA表達(dá)譜高通量測(cè)序根據(jù)超聲心動(dòng)圖和心肌組織病理檢查結(jié)果，進(jìn)一步應(yīng)用低壓低氧暴露7 d組和常壓常氧對(duì)照組大鼠心肌組織進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序。應(yīng)用Trizol試劑提取大鼠左心室心肌組織總RNA，質(zhì)檢合格的RNA進(jìn)行文庫構(gòu)建。使用HiSeq2500進(jìn)行高通量測(cè)序（每組6只），檢測(cè)miRNA表達(dá)譜。使用FastQC對(duì)原始序列進(jìn)行檢測(cè)，保留高質(zhì)量的整潔序列（clean reads）。使用Cufflinks 2.0對(duì)所有轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行匯總整合，并使用Ensemble轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的結(jié)果進(jìn)行注釋。使用Cufflinks軟件篩選差異基因。差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)滿足以下條件：①在兩個(gè)樣本中測(cè)序讀數(shù)之和≥10的基因；②滿足│log2（FC）│＞1（上調(diào)2倍或下調(diào)2倍）；③同時(shí)滿足P＜0.05和FDR（false discovery rate）＜0.05。高通量測(cè)序檢測(cè)由北京博奧公司協(xié)助完成。

1.6 差異表達(dá)miRNA的生物信息學(xué)分析獲取差異表達(dá)miRNA后，使用DAVID在線工具進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路富集分析。使用cytoscape3.3進(jìn)行可視化，觀察差異表達(dá)基因在信號(hào)通路上的富集情況。使用兩個(gè)常用靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan和miRanda對(duì)差異表達(dá)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用TAM（http：//www.cuilab.cn/tam）軟件分別對(duì)高表達(dá)miRNA和低表達(dá)miRNA進(jìn)行miRNA功能、相關(guān)疾病、miRNA家族和miRNA簇富集分析。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)差異表達(dá)miRNA在心肌組織表達(dá)水平隨機(jī)選取5個(gè)顯著差異表達(dá)miRNA，應(yīng)用熒光定量PCR方法，檢測(cè)其在常壓常氧對(duì)照組和低壓低氧暴露7 d組大鼠心肌組織表達(dá)水平。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)差異表達(dá)miRNA在血漿表達(dá)水平隨機(jī)選取5個(gè)顯著差異表達(dá)miRNA，應(yīng)用熒光定量PCR方法，檢測(cè)其在常壓常氧對(duì)照組和低壓低氧暴露7 d組大鼠血漿表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異采用方差檢驗(yàn)，分析組間差異的顯著性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建模擬高原低氧心肌損傷動(dòng)物模型①超聲心動(dòng)圖結(jié)果示，四組實(shí)驗(yàn)組大鼠PV peak velocity和PV peak gradient數(shù)值均低于對(duì)照組，其中低壓低氧7 d組上述生理參數(shù)下降最為明顯。與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。②低壓低氧暴露3 d組和7 d組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和FS低于對(duì)照組，低壓低氧暴露14 d組和28 d組大鼠LVEF和FS高于對(duì)照組。與對(duì)照組比較，低壓低氧暴露7 d組大鼠LVEF和FS下降最為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。由于進(jìn)入高原后7 d大鼠左心室收縮和舒張功能受損最嚴(yán)重，提示進(jìn)入高原后第7 d是造成大鼠心功能損傷的重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

2.2 心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果心肌組織HE染色病理切片光鏡下所見（圖1）。對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞界限清楚，可見肌原纖維和橫紋，胞核清晰，肌漿未見變性和壞死。低壓低氧3 d組可見心肌灶狀變性和壞死，伴炎性細(xì)胞灶狀浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生，肌漿凝聚，橫紋不清。低壓低氧7 d組可見心肌粗細(xì)不均，間質(zhì)增寬，血管擴(kuò)張，個(gè)別心肌細(xì)胞可見斷裂、腫脹，肌漿凝聚，紅染，橫紋不清。低壓低氧14 d組可見心肌細(xì)胞排列紊亂、稀疏，間質(zhì)增寬，血管擴(kuò)張，心肌可見斷裂、腫脹，肌漿凝聚，紅染，橫紋不清。心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生明顯，并有膠原纖維排列，心內(nèi)膜下成片炎細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞和膠原纖維增生。低壓低氧28 d組可見心肌細(xì)胞排列明顯稀疏，間質(zhì)增寬，血管擴(kuò)張。部分區(qū)域心肌間質(zhì)出血明顯，心肌細(xì)胞胞核減少。

2.3 心肌組織高通量測(cè)序和差異表達(dá)miRNA篩選miRNA高通量測(cè)序共篩選出18個(gè)顯著差異表達(dá)miRNA，其中15個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，3個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)（圖2）。選取5個(gè)差異表達(dá)miRNA（miR-144-3p、miR-144-5p、miR-132-3p、miR-212-5p、miR-672-3p），應(yīng)用熒光定量PCR法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。cel-miR-39作為內(nèi)參。熒光定量PCR檢測(cè)的miRNA表達(dá)趨勢(shì)與miRNA高通量測(cè)序結(jié)果一致（圖3）。miRNA引物由廣州瑞博公司設(shè)計(jì)合成，采用莖環(huán)合成法。

2.4 差異基因的功能富集和信號(hào)通路富集分析使用GO、KEGG、DAVID等功能通路分析工具，分析差異表達(dá)miRNA富集功能和信號(hào)通路。發(fā)現(xiàn)很多已報(bào)道的與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、自噬、炎癥等緊密相關(guān)的功能基因（如Nrf2、Sirt2、FOXO3、HO-1、SOD1、NOX4、BCl2、IL-6等）存在差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)的靶基因中。推測(cè)差異表達(dá)miRNA可能通過Nrf2、mTOR等經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥、自噬等病理生理過程，參與低壓低氧誘導(dǎo)的心肌損傷。研究發(fā)現(xiàn)，與高表達(dá)miRNA相關(guān)的前6位疾病分別為肺癌、疼痛、乳腺癌、腫瘤、炎癥、心肌梗死。與高表達(dá)miRNA相關(guān)的前3位生物學(xué)功能分別為circadian clock（生物鐘）、circadian rhythm（晝夜節(jié)律）、apoptosis（凋亡）。與差異表達(dá)miRNA相關(guān)的miRNA家族是miR-132家族和miR-29家族。

表1 大鼠超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果（±s）

表1 大鼠超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果（±s）

組別 例數(shù)左室舒張末期內(nèi)徑（m m）P V峰值梯度（m m H g）收縮末期內(nèi)徑（m m）舒張末期左室前壁厚度（m m）舒張末期左室后壁厚度（m m）射血分?jǐn)?shù)（%）短軸縮短率（%）P V峰值速度（m m/s）對(duì)照組 6 6.2 9±0.5 0 3.2 0±0.6 6 1.8 5±0.5 1 1.5 8±0.2 5 7 8.9 1±7.9 7 4 9.4 3±7.8 0 8 7 6.8 8±2 4.8 8 3.0 9±0.7 8 3 d 7 5.6 6±0.6 1 3.0 3±0.5 6 2.2 2±0.3 9 1.7 8±0.3 6 7 6.8 4±5.0 9 4 6.8 6±5.3 2 8 1 9.7 4±7 2.5 3 2.7 2±0.4 9 7 d 8 5.5 3±0.8 3 3.0 9±0.7 9 1.8 3±0.3 9 1.8 2±0.4 2 7 3.5 2±7.9 0 4 3.8 6+7.8 7 3 6 7.8 5±1 3 2 0.6 1±0.6 2 1 4 d 8 5.8 9±0.6 1 2.6 7±0.3 9 2.0 7±0.6 0 2.5 1±0.3 3 8 3.9 7±5.7 0 5 4.4 4±6.1 5 7 8 7.4 8±6 6.8 2 2.5 1±0.4 4 2 8 d 7 5.3 5±0.5 8 2.3 2±0.4 0 3.0 5±0.4 6 2.8 9±0.5 3 8 6.3 1±3.1 3 5 6.9 0±3.8 5 7 8 4.1 9±2 7.4 6 2.4 7±0.1 7

圖1 大鼠心肌組織HE染色病理結(jié)果（光鏡，×100）

圖2 大鼠心肌組織差異表達(dá)miRNA熱圖

圖3 低壓低氧暴露7 d大鼠心肌miRNA表達(dá)

與差異表達(dá)miRNA相關(guān)的miRNA簇分別為miR-182簇，miR-29a簇和miR-132簇。與表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA相關(guān)的前六位疾病分別為心臟擴(kuò)大、腺皮質(zhì)腫瘤、腺皮質(zhì)腺瘤、肌源性萎縮、冠狀動(dòng)脈疾病、鼻咽癌。與表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA相關(guān)的生物學(xué)功能主要為膽固醇生物合成。與表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA相關(guān)的miRNA家族為miR-208家族和miR-199家族。與表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA相關(guān)的miRNA簇為miR-489簇、miR-208a簇和miR-193b簇。對(duì)于差異表達(dá)miRNA的生物信息學(xué)分析結(jié)果提示，生物鐘基因、晝夜節(jié)律基因、凋亡基因等可能是造成低壓低氧心肌損傷的主要功能基因。

2.5 低壓低氧7 d大鼠血漿miRNA表達(dá)應(yīng)用熒光定量PCR法分別檢測(cè)常壓常氧對(duì)照組、低壓低氧7 d組大鼠血漿中5個(gè)miRNA（miR-144-3p、miR-144-5p、miR-132-3p、miR-212-5p、miR-672-3p）的表達(dá)水平（圖4），應(yīng)用cel-miR-39作為內(nèi)參。miRNA引物由廣州瑞博公司設(shè)計(jì)合成，采用莖環(huán)合成法。圖4示，低壓低氧7 d組大鼠血漿中miR-144-3p表達(dá)豐度較對(duì)照組顯著升高，與心肌組織miR-144-3p的表達(dá)趨勢(shì)一致。心肌組織中表達(dá)顯著升高的其余4個(gè)miRNA（miR-144-5p，miR-212-5p，miR-132-3p），其在血漿中的表達(dá)豐度與對(duì)照組比較無顯著差異。

2.6 低壓低氧不同時(shí)間血漿中miR-144-3p表達(dá)水平檢測(cè)應(yīng)用熒光定量PCR法分別檢測(cè)對(duì)照組、D3組、D7組、D14組和D28組大鼠血漿中miR-144-3p表達(dá)水平（圖5）。PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著低壓低氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，血漿miR-144-3p表達(dá)水平逐漸升高。綜合高通量測(cè)序、心肌組織和血漿miRNA的PCR檢測(cè)結(jié)果，我們預(yù)測(cè)血漿miR-144-3p可能成為評(píng)估高原低壓低氧心肌損傷的潛在生物標(biāo)志物。

圖4 低壓低氧暴露7 d大鼠血漿miRNA表達(dá)

圖5 低壓低氧暴露不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿miR-144-3p表達(dá)

3 討論

本課題組根據(jù)既往實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用低壓氧艙模擬高原環(huán)境，構(gòu)建了急性高原低壓低氧心肌損傷大鼠模型。根據(jù)超聲心動(dòng)圖和大鼠心肌組織病理，我們選擇低壓低氧暴露7 d大鼠心肌組織進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜高通量測(cè)序，并對(duì)差異基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。生物信息學(xué)分析結(jié)果提示，低壓低氧可導(dǎo)致大鼠心肌組織miRNA表達(dá)譜發(fā)生顯著變化。差異表達(dá)miRNA主要為miR-144/451基因簇、miR-132/212基因簇。心肌組織和血漿miRNA檢測(cè)結(jié)果提示，miR-144-3p與高原低氧心肌損傷密切相關(guān)。

近年來國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，miR-144既是紅系分化的重要調(diào)節(jié)因子，也參與了腫瘤、心腦血管病的發(fā)生、發(fā)展。miR-144可參與紅細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)早期紅細(xì)胞成熟和增生[2]。miR-144敲除協(xié)同氧化應(yīng)激可導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)生嚴(yán)重貧血[3]。miR-144高表達(dá)時(shí)，鐮狀紅細(xì)胞貧血更加嚴(yán)重[4]。其機(jī)制可能為miR-144靶向下調(diào)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，NRF2），從而降低谷胱甘肽產(chǎn)生，降低紅細(xì)胞抗氧化能力。miR-144除了參與紅細(xì)胞氧化應(yīng)激，還可通過調(diào)控靶基因細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[5]。此外，miR-144可通過調(diào)控編碼死亡受體、Caspases和其他凋亡相關(guān)基因來影響Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]。將miR-144類似物轉(zhuǎn)染大鼠H9C2心肌細(xì)胞，可見心肌細(xì)胞增生顯著降低、Caspases-3活性升高、細(xì)胞凋亡率升高，提示miR-144是促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的基因[7]。

國(guó)內(nèi)外多個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)也提示miR-144-3p與心肌梗死、心律失常等心血管疾病相關(guān)。Hu等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p類似物可抑制ABCA1基因，提高炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）表達(dá)。急性心?；颊哐h(huán)miR-144-3p表達(dá)豐度與血清肌酸激酶（CK），肌酸激酶同工酶（CK-MB），乳酸脫氫酶（LDH）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）表達(dá)呈正相關(guān)。提示miR-144-3p是調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)定性和炎性反應(yīng)的基礎(chǔ)，可能成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn)和有前景的診斷急性心肌梗死的生物標(biāo)志物。Bye等在HUNT研究發(fā)現(xiàn)[9]，聯(lián)合檢測(cè)miR-144-3p等5個(gè)循環(huán)miRNA和Framingham危險(xiǎn)評(píng)分,可將健康人群發(fā)生急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)陽性率自0.72提升至0.91（P＜0.01）。Yamada等[10]檢測(cè)了致心律失常性右室心肌病合并室性心律失?；颊哐獫{miRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)血漿miR-144-3p和其他三個(gè)miRNAs（miR-145-5p，miR-185-5p，miR-494）表達(dá)豐度升高。我國(guó)Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p過表達(dá)能夠顯著降低細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高氧化應(yīng)激反應(yīng)。下調(diào)miR-144-3p能夠提高靶基因NRF2表達(dá)及ARE的活性。上述臨床研究均提示miR-144-3p可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、離子通道等參與心肌損傷的病理生理過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，高原低壓低氧導(dǎo)致的受損心肌組織中，miR-144-3p和miR-144-5p的表達(dá)水平都上調(diào)。隨著高原低氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，血漿中miR-144-3p表達(dá)水平升高，血漿miR-144-3p可能是反應(yīng)高原低壓低氧心肌損傷的潛在的生物標(biāo)志物。通過本研究，將深化有關(guān)高原低壓低氧心肌損傷發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí),為探索防治高原心臟病的新策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。