NtCycB2基因表達對煙草腺毛發(fā)生的影響

孟盈，閆筱筱，王召軍，張洪映，楊欣玲，楊永鋒，崔紅*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002；

2 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，鄭州市隴海東路72號 450000

煙草植株的氣生部分密被腺毛，對植株抗性和煙葉質(zhì)量具有重要影響[1]。栽培煙草的腺毛主要由三種類型混合組成。其中，長柄分泌型腺毛為主要類型，是二萜和糖脂合成的重要場所，二者不僅是重要香氣前體物質(zhì)[2]，對蚜蟲抗性也有較大影響[3]。短柄分泌型腺毛是葉面抗性蛋白的合成場所，在抑制孢子萌發(fā)和抵抗真菌侵染中起重要作用[4]。構(gòu)成了煙株與環(huán)境間的物理屏障，可以有效地防御各種非生物脅迫及生物脅迫[5]。因此，提高腺毛密度是煙草品質(zhì)和抗性改良的重要途徑之一，而這依賴于對煙草腺毛形態(tài)發(fā)生分子機制的全面解析。

雖然，擬南芥單細(xì)胞腺毛發(fā)生分子機制研究已取得了突破性進展，但多細(xì)胞腺毛與單細(xì)胞腺毛在發(fā)生調(diào)控機制上有并不相同[6-8]。細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）在真核細(xì)胞分裂過程中起調(diào)控作用，對細(xì)胞增殖及植物發(fā)育有重要意義[9]。Cyclins共有A、B、C、D、H、L、T、U、SDS和J18-type 10個家族，功能各不相同[10]。其中，B-型細(xì)胞周期蛋白（B-type cyclins）控制核內(nèi)復(fù)制（G2）期轉(zhuǎn)向分裂（M）期的轉(zhuǎn)換[11]，過量表達CycB2的水稻能促進細(xì)胞分裂，加快水稻根系的生長，與CDKB2相互作用后調(diào)節(jié)水稻根系的生長發(fā)育[12]；在種子發(fā)育過程中也可以發(fā)揮作用，玉米CycB2與CDKA相互作用后，共同參與調(diào)控胚乳發(fā)育過程中的細(xì)胞周期[13]；對腺毛發(fā)生也有影響，CycB1;2在GL2啟動子控制下在擬南芥腺毛中表達，可使單細(xì)胞腺毛轉(zhuǎn)變?yōu)閰采亩嗉?xì)胞型腺毛[14]。SlCycB2是從番茄wooly突變體中發(fā)現(xiàn)的B型細(xì)胞周期蛋白基因，當(dāng)SlCycB2的表達受到抑制時，非分泌型腺毛（III和V型）明顯增多，分泌型腺毛（I和IV型）消失；當(dāng)SlCycB2過表達時，非分泌型腺毛及分泌型腺毛都明顯減少[15-16]。這反映出多細(xì)胞腺毛發(fā)生調(diào)控機制的精細(xì)和復(fù)雜性，也說明B型細(xì)胞周期蛋白在多細(xì)胞腺毛發(fā)生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有舉足輕重的地位。

煙草腺毛密度受到多種栽培因素[17-23]與環(huán)境因子[24-27]的影響，但其遺傳調(diào)控機制還不清晰。雖然有研究表明NtCycB2在煙草中的過表達及在番茄中異源表達都出現(xiàn)抑制腺毛發(fā)生的現(xiàn)象[16]，但該基因在煙草中的表達模式及對不同類型腺毛發(fā)生的調(diào)控模式并未報道。為此，本研究采用RT-PCR技術(shù)，進行煙草K326 NtCycB2克隆和生物信息學(xué)分析，分別構(gòu)建過表達載體和基因編輯載體進行遺傳轉(zhuǎn)化分析，通過腺毛形態(tài)的比較研究解析了，深入解析NtCycB2表達對煙草腺毛形態(tài)發(fā)生的調(diào)控作用，旨在為煙草葉面化學(xué)分子定向改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料煙草K326無菌苗培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)溫度為25℃、濕度為60%，光照條件為16 h光/8 h暗。

1.2 基因克隆和序列分析

利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計NtCycB2克隆引 物（F1：ATGAGCCGAAGAAATGGAAAT，R1：CTAACTGATATTCCTCCTAGTAG）和高保真Pfu酶進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C 10min；94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，35次 循 環(huán)；72°C 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用天根公司DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，酶切鑒定后送深圳華大公司進行測序驗證。

根據(jù)茄科基因組網(wǎng)站（https://solgenomics.net/）、中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫（V3.0）和擬南芥TAIR網(wǎng)站（https://www.arabidopsis.org）獲取相關(guān)CycB2基因的序列。利用Prosite數(shù)據(jù)庫（https://www.expasy.org/tools/）分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，使用ProtParam程序（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測氨基酸分子量。利用Clustal Omega program（https://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/）和MEGA5.0軟件進行進化和多序列比對分析。利用NCBI Conserved Domain Database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析CycB2基因的保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 基因表達模式分析

選擇五葉期生長一致的幼苗進行非生物脅迫處理：100μmol·L-1MeJA溶液進行外源激素處理，150mmol·L-1NaCl溶液進行高鹽脅迫，20% PEG6000溶液進行滲透脅迫，4℃進行低溫脅迫和42℃進行高溫脅迫。分別在脅迫處理0、1、6、12和24h進行樣品收集，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃。Trozol法提取RNA。反轉(zhuǎn)錄程序參照Invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒說明書進行。

以煙草L25核糖體蛋白（L18908）（F2：GCTTTCTT CGTCCCATCA，R2：CCCCAAGTACCCTCG TAT）為內(nèi)參[28]，按照Invitrogen公司的2×RealStar Green Fast Mixture（SYBR Green）試劑盒說明書，利用F1/R1引物進行實時定量RT-PCR。20 μL反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10.0 μL，上、下游引物（10.0 μmol L-1）各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，RNasefree H2O 8.0 μL。反應(yīng)條件為95°C 10 min；95°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，40次 循 環(huán)；在72°C延伸步驟收集熒光信號，溶解曲線為：95°C，15s。采用2-△△Ct法[29]進行誤差分析。

1.4 載體構(gòu)建

利用NtCycB2克隆引物（F3：CGGGATCCATG AGCCGAAGAAATGGAAAT，R3：CGGAATTCC TAACTGATATTCCTCCTAGTAG，下劃線標(biāo)注的酶切位點分別是BamHI和EcoRI）進行PCR擴增。將測序正確的目的基因連接到過表達載體構(gòu)成pCXSNFLAG-NtCycB2。

根據(jù)測序得到的NtCycB2的CDS序列，首先設(shè)計并合成gRNA靶位點序列（Targeting Sequence：GATCAACCACCCACAAGTGG，下劃線標(biāo)注的是Protospacer Adjacent Motifs，即PAM區(qū)），并添加BsaI酶切位點。Oligo二聚體與CRISPR/Cas9載體進行連接：CRISPR/Cas9載體2.0μL，Oligo二聚體1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，無菌水H2O補充至10.0 μL。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中構(gòu)成NtCycB2-knock out基因編輯載體（圖1）。

圖1 NtCycB2基因敲除載體結(jié)構(gòu)Fig.1 Vector structure of NtCycB2-knock out

1.5 煙草遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定

煙草轉(zhuǎn)基因采用葉盤轉(zhuǎn)化法[30]。NtCycB2過表達載體和基因敲除載體轉(zhuǎn)化后將葉片組織轉(zhuǎn)移到含有潮霉素（60.0 mg·L-1）的分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)和抗性篩選。獲得的敲除表達抗性株系進行靶位點附近序列的測序分析，通過檢測靶位點堿基突變情況確定敲除株系。

利用F1/R1引物對過表達抗性株系進行RT-PCR檢測分析，方法同1.3。

1.6 腺毛形態(tài)觀察

葉片腺毛組織化學(xué)染色法參考Lin和Wagner的方法[31]。將葉片在0.2%（w/v）羅丹明B水溶液中浸染30min，用蒸餾水漂洗三次，使用無菌濾紙吸干表面水分后，利用超景深顯微鏡（基恩士VHR-5000，日本）對葉片表面進行觀察，并在上表皮中部隨機選擇3個視野進行腺毛密度統(tǒng)計分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)使用EXCEL進行整理，應(yīng)用SPSS17.0軟件（IBM，美國）進行顯著性分析，數(shù)據(jù)處理采用單因子方差（One-way ANOVA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtCycB2基因克隆及生物信息學(xué)分析

以K326的DNA為模板，利用NtCycB2克隆引物進行PCR擴增后，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)長333bp，共兩個拷貝，NtCycB2-1、NtCycB2-2核苷酸同源性達94%，氨基酸相似性100%。編碼110個氨基酸，分子量為12.2kD，理論等電點為8.60，酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為11，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為14，其分子式為C509H847N153O169S11。

圖2 煙草NtCycB2基因克隆Fig.2 PCR amplification of NtCycB2

圖3 NtCycB2蛋白與近源物種同源蛋白的多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of NtCycB2 protein and relative species homolog protein

NCBI網(wǎng)站在線分析CycB2基因具有三個典型的Motifs：I、II和III（圖3），其中，Motifi和II構(gòu)成WD40結(jié)構(gòu)域，MotifiII構(gòu)成RING-Like結(jié)構(gòu)域。蛋白序列比對分析結(jié)果表明K326 NtCycB2蛋白序列與其親本絨毛煙草（NtomCycB2：Ntom_KB972106.1）和林煙草（NsylCycB2：Nsyl_KD960057.1）的蛋白序列相同，與香料煙巴斯瑪（BXCycB2：Ntab-BX_AWOK-SS231466）、白 肋 煙TN90（TN90CycB2：Ntab-TN90_AYMY-SS4464）和紅花大金元（HDCycB2：Ntab0642370.1）的蛋白序列也相同；而與本氏煙（NbCycB2-1：Niben101Scf10299g00003.1和NbCycB2-2：Niben101Scf10396g00002.1）蛋 白序列的同源性均為96.36%，與番茄（SlCycB2：Solyc10g083140）、擬南芥（AtCycB2：AT5G06270和AtCycB3：AT3G11600）蛋白序列的同源性分別為71.05%、52.38%、和51.20%。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果也表明，CycB2在栽培煙草不同類型、不同品種及其親本之間高度保守，但與本氏煙NbCycB2存在較大差異，與番茄SlCycB2及擬南芥AtCycB2的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

圖4 CycB2蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CycB2 protein

2.2 NtCycB2基因表達模式分析

為研究NtCycB2的組織表達特性，分別對煙草根、莖、葉、去腺毛葉、花和腺毛中NtCycB2表達水平進行RT-PCR檢測分析，結(jié)果如圖5A所示。腺毛和花中NtCycB2的表達水平最高，分別是根的7.6倍和5.2倍。NtCycB2表達水平在根和莖中較低，在葉片中相對較高，但在去腺毛葉片中明顯降低。由此推測，NtCycB2主要在煙草腺毛中富集表達，這與SlCycB2在番茄腺毛中特異表達相一致。

圖5 NtCycB2基因表達模式分析Fig.5 Response of NtCycB2 to different stress treatments

為研究NtCycB2對逆境的應(yīng)答模式，采用RTPCR技術(shù)，分析了水分、鹽、溫度、MeJA等脅迫條件下葉片NtCycB2表達水平的變化規(guī)律。在PEG和NaCl處理下，NtCycB2表達水平隨處理時間延長而逐漸降低（圖5-B，C），表明干旱和鹽脅迫對NtCycB2表達具有一定的抑制作用。在高溫處理下，NtCycB2表達水平隨處理時間延長而逐漸升高，而在低溫處理下顯示出明顯降低的趨勢，說明溫度對NtCycB2表達具有一定的誘導(dǎo)作用。在MeJA處理12h時NtCycB2表達量陡升，在24h時又明顯降低，表明了MeJA對NtCycB2表達的調(diào)控具有一定的時間效應(yīng)。

2.3 遺傳轉(zhuǎn)化與篩選鑒定

2.3.1 NtCycB2基因敲除

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將NtCycB2-knockout表達載體轉(zhuǎn)化K326，對獲得的潮霉素抗性苗進行PCR擴增和測序，在所檢測的40株抗性苗中，有19株在靶位點序列檢測到了雙峰現(xiàn)象，編輯效率接近50%。在T1代中篩選中，獲得了4個在靶位點序列發(fā)生了插入或缺失突變的純合突變體。如圖6顯示，NtCycB2-ko-2的序列中第76堿基位置后出現(xiàn)C插入；NtCycB2-ko-3的序列中第73堿基位置的CCA缺失，第76堿基位置后出現(xiàn)C插入；NtCycB2-ko-15的序列中第73堿基位置的CCAC缺失；NtCycB2-ko-16第76堿基位置后出T插入。這些插入和缺失最終都導(dǎo)致了NtCycB2翻譯的終止。

圖6 NtCycB2基因敲除株系中NtCycB2序列分析Fig.6 Sequence analysis of NtCycB2 among different NtCycB2-knockout lines

2.3.2 NtCycB2基因過表達

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCXSN-FLAG-NtCycB2表達載體轉(zhuǎn)化K326，并對抗性芽/幼苗進行潮霉素抗性篩選。采用RT-PCR技術(shù)對該植株（NtCycB2-OE-1）和4個基因敲除株系（NtCycB2-ko-2、NtCycB2-ko-3、NtCycB2-ko-15和NtCycB2-ko-16）的純合突變體進行NtCycB2表達水平分析，結(jié)果如圖7所示。NtCycB2-OE-1植株中NtCycB2的表達量明顯較高，是對照K326的3.1倍。而四個敲除株系中NtCycB2表達量與對照相近，表明其在轉(zhuǎn)錄水平并無明顯變化。

2.4 NtCycB2轉(zhuǎn)基因植株腺毛形態(tài)觀察和腺毛密度分析

對NtCycB2敲除和過表達株系幼苗進行了形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖8所示，NtCycB2-ko-2植株形態(tài)與對照相似，但莖和葉上的腺毛更為濃密，整個植株呈現(xiàn)多毛狀態(tài)（圖8B）。NtCycB2-OE-1植株與對照形態(tài)有所不同，不僅葉片和莖表面光滑少毛，而且葉面光亮、葉片卷曲，形狀不規(guī)則（圖8C）。

經(jīng)羅丹明染色后對不同株系的腺毛進行觀察，圖8-D、E和F顯示了NtCycB2表達對莖部腺毛發(fā)生的影響。與對照相比，NtCycB2-ko-2莖上腺毛濃密，腺柄較長，腺頭較為飽滿；而NtCycB2-OE-1莖表十分光滑，長柄腺毛幾乎消失，僅觀察到少量的短柄分泌型腺毛。圖8-G、H和I顯示了NtCycB2表達對葉面腺毛發(fā)生的影響。與對照相比，NtCycB2-ko植株葉面的腺毛數(shù)量顯著增加，大部分為長柄分泌型腺毛，腺頭著色較深，表明其物質(zhì)代謝和分泌功能旺盛；而NtCycB2-OE-1葉面分泌型腺毛和非分泌型腺毛數(shù)量明顯減少，僅有少量的短柄分泌型腺毛存留。

圖8 NtCycB2基因敲除和過表達株系的腺毛分析（150×）Fig.8 Trichome analysis of NtCycB2 knock-out lines and overexpression line（150×）

分別取NtCycB2敲除株系和過表達株系的幼葉進行上表皮腺毛密度統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖9所示。4個NtCycB2敲 除 株 系NtCycB2-ko-2、NtCycB2-ko-3、NtCycB2-ko-15和NtCycB2-ko-16植株的葉面腺毛總數(shù)顯著高于對照。其中，長柄型或短柄型的分泌型腺毛的密度都顯著增加，而非分泌型腺毛的密度則沒有明顯改變。NtCycB2-OE-1株系中分泌型腺毛和非分泌型腺毛數(shù)量均顯著減少，且均呈現(xiàn)顯著性差異。該結(jié)果表明，NtCycB2對煙草腺毛發(fā)生尤其是分泌型腺毛的發(fā)生，具有明顯的負(fù)向調(diào)控作用。

圖9 NtCycB2敲除和過表達株系的葉面腺毛密度統(tǒng)計Fig.9 Statistics of trichome density of leaf surface of NtCycB2 knock-out line and over-expression line

3 討論和結(jié)論

植物腺毛作為表皮細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu)，在植物抵御環(huán)境脅迫[32]和次生代謝產(chǎn)物積累[33]等方面發(fā)揮重要作用。煙草腺毛由多種分泌型和非分泌型腺毛混合組成，既形成了煙株與外界的物理屏障和化學(xué)屏障，同時又是重要的香氣前體物質(zhì)合成場所。因此，提高煙草腺毛密度是煙草的重要目標(biāo)。但栽培煙草遺傳背景狹窄、腺毛密度變異較小[34]，常規(guī)的雜交育種難以有所突破。而利用關(guān)鍵基因的表達調(diào)控進行分子改良，是煙草腺毛密度改良的主要途徑。

模式植物擬南芥為代表的單細(xì)胞腺毛發(fā)生已被逐步解析[35]，但多細(xì)胞腺毛發(fā)生的分子機制還不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)番茄多細(xì)胞腺毛發(fā)生受到B型周期蛋白的調(diào)控，為煙草腺毛分子改良提供了理想的靶點。因此，本文克隆并分析了K326的B型周期蛋白NtCycB2。雖然NtCycB2氨基酸序列在栽培煙草不同類型和不同品種中高度保守，但與番茄SlCycB2相似性僅71.05%，預(yù)示二者之間的功能同中存異。為闡明NtCycB2在煙草腺毛發(fā)生中的調(diào)控作用，分別對該基因進行了過表達和敲除表達研究。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，NtCycB2過表達植株莖和葉光滑少毛，葉片上除了少量短柄分泌型腺毛外，長柄分泌型和非分泌型腺毛基本消失；而NtCycB2敲除植株中莖葉呈現(xiàn)多毛現(xiàn)象，分泌型腺毛密度顯著增加，而非分泌型腺毛無明顯變化。該結(jié)果證明，NtCycB2對煙草分泌型腺毛具有顯著的負(fù)調(diào)控作用，這與番茄的研究結(jié)果有所不同。番茄共有7種類型的腺毛，包括4種分泌型（I、IV、VI與VII）和3種非分泌型（II、III和V）[36]。SlCycB2對III和V型非分泌型腺毛具有明顯的負(fù)調(diào)控作用，SlCycB2過表達和抑制都會導(dǎo)致I型腺毛的完全消失，對于其它類型腺毛發(fā)生無明顯影響[16]。B型細(xì)胞周期蛋白在煙草和番茄中都具有調(diào)控腺毛發(fā)生的功能，但調(diào)控模式存在明顯差異，其中原因并不清楚。這充分說明了多細(xì)胞腺毛發(fā)生調(diào)控機制的復(fù)雜性，其不僅具有物種特異性，也具有腺毛類型的特異性。而NtCycB2對煙草分泌型腺毛顯著的負(fù)調(diào)控作用，預(yù)示其在煙草葉面化學(xué)定向改良中具有較大的應(yīng)用潛力。其一，該基因的靶標(biāo)-長柄分泌型腺毛是葉面化學(xué)物質(zhì)合成的重要場所；其二，該基因的負(fù)向調(diào)控模式有利于基因編輯技術(shù)的應(yīng)用，而基因編輯技術(shù)改良品種無疑具有較大的公眾接受性和應(yīng)用空間。

當(dāng)然，在此之前還應(yīng)充分評估NtCycB2表達對煙草生長發(fā)育的影響。NtCycB2表達模式分析發(fā)現(xiàn)，該基因主要在腺毛和花中高表達，這與SlCycB2相一致，預(yù)示其主要影響植物的腺毛和花器的發(fā)育過程。SlCycB2過表達導(dǎo)致了胚胎發(fā)育受阻和不育[37]，NtCycB2過表達使煙苗形態(tài)出現(xiàn)了異常，說明其過表達對植物生長發(fā)育和生殖有一定負(fù)作用。但到目前為止，還沒有關(guān)于CycB2敲除影響植株生長發(fā)育的報道。在本研究中，NtCycB2敲除后，煙苗腺毛濃密，發(fā)育正常，生長旺盛，預(yù)示其在生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用潛力。當(dāng)然，下一步但還需要進行田間比較試驗，以闡明NtCycB2敲除對煙株農(nóng)藝性狀、葉面化學(xué)、煙葉質(zhì)量及其可用性的重要影響，為煙草葉面化學(xué)的定向改良奠定基礎(chǔ)。