煙草NtSAP5基因克隆及干旱脅迫下的功能鑒定

白戈，楊大海，姚恒，謝賀

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，育種與生物技術(shù)研究中心，云南昆明圓通街33號 650021

外界環(huán)境條件能夠顯著地影響植物的生長和發(fā)育，植物為了能夠適應外界逆境條件，進化出了復雜的生理及分子響應機制[1-3]。已發(fā)現(xiàn)多種植物基因參與到植物抗逆過程，如bHLH蛋白、NAC蛋白、AP2/EREBP等轉(zhuǎn)錄因子尤為重要[2,4-5]。其中一類轉(zhuǎn)錄因子Stress Associated protein （SAP）基因家族在調(diào)控植物抗逆過程中非常重要。該基因家族的大多數(shù)基因具有兩個鋅指基序，在N端具有一個A20結(jié)構(gòu)域，在C端具有一個AN1鋅指結(jié)構(gòu)域[6]。

水稻的OSISAP1及OSISAP8基因能夠被諸如冷、脫水、鹽、重金屬、傷害及ABA等多種逆境條件誘導，在水稻中過表達OSISAP1能夠誘導WRKY76、OsRCI2-5等抗逆基因表達并提高水稻抗旱能力[7]。在煙草中過表達OSISAP1及OSISAP8基因會提高煙草的耐冷性、耐旱性、耐鹽性[6,8]。水稻已鑒定出一組A20/AN1類型的鋅指蛋白，包括ZFP177、ZFP181、 ZFP176、ZFP173、ZFP181、ZFP176及ZFP157，這些基因能夠被冷、干旱及雙氧水脅迫誘導。在煙草中過表達ZFP177能夠提高煙草對高溫及低溫的抗性，但該轉(zhuǎn)基因煙草對干旱及鹽脅迫更敏感[9]。在擬南芥中過表達擬南芥內(nèi)源AtSAP5基因能夠顯著的提高擬南芥的抗旱性，該基因所對應的T-DNA插入突變體則對干旱脅迫表現(xiàn)敏感[10]。SAP類鋅指蛋白在植物干旱等逆境中發(fā)揮功能，其部分成員的抗旱功能在擬南芥、水稻等多個物種中得到了驗證，但在茄科物種中物種自身的SAP類基因在干旱條件下的作用研究較少。本文克隆了煙草中NtSAP5基因并對該基因的組織特異表達及干旱條件下的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，對過表達后的抗旱表型進行分析，為研究煙草對干旱響應及抗旱分子機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料、種植條件及干旱脅迫處理

用于基因表達分析的煙草栽培品種K326，種子由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院保存。K326種子在花盆中萌發(fā)，在16小時光照、28℃，8小時黑暗、23℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長。

本文采用了2種干旱處理條件：一是6～7葉煙草幼苗，移出花盆，清水漂去根部的培養(yǎng)基質(zhì)，用濾紙吸干根部水分；然后將煙草植株整體在空氣中干燥，在處理的0 h、0.5 h、1 h取葉片樣品，方法詳見文獻[7]；二是6～7葉時煙草幼苗停止?jié)菜?天，觀察抗旱表型。取樣樣本液氮速凍，保存于-80℃中用于RNA提取。

1.2 煙草RNA提取與cDNA制備

采用Qiagen RNeasy mini plant kit（Cat 74104 ）提取煙草的RNA。在冰上準備10 μL的反轉(zhuǎn)錄反應體系，包括2 μg總RNA、1 μL的50 μM oligo（dT）和1 μL的10 mM dNTP和適量經(jīng)DEPC處理過的水，將該體系在65℃溫浴5 min后，迅速置于冰上1 min。

將上述體系中加入2 μL的10× RT Buffer、4 μL的25 mM MgCl2、2 μL的0.1 M DTT、1 μL的RNaseOUT（40 U/μL）和1 μL的SuperScript III RT（200 U/μL）后，在50℃下保持50 min，并在85℃下使酶失活、在冰上冷卻終止反應，即獲得cDNA。

1.3 基因克隆

根據(jù)中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫基因ID Ntab0877490設(shè)計引物，采用PCR方法克隆獲得候選基因片段，PCR擴增的詳細步驟及注意事項請參考《分子克隆實驗指南（上冊）》?？寺∩嫌我颪tSAP5-F：5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC ATGGCTCAGAGAACAGAGAAAG-3',下游克隆引NtSAP5-R：5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAG CTGGGTCTCAAAGTTTAACGATCTTCG -3'。（標下劃線部分為gateway接頭序列，用來發(fā)生重組反應將序列導入到pDONR-Zeo載體中）根據(jù)gateway BP反應將擴增獲得到的片段通過重組反應導入到pDONR-Zeo載體中。然后將含有NtSAP5序列的pDONR-Zeo通過LR反應導入到gateway過表達載體pB2GW7中。

1.4 植物轉(zhuǎn)基因

將含有NtSAP5片段的pB2GW7載體通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中。然后采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草品種K326。通過Basta抗生素篩選獲得具有NtSAP5基因的過表達材料。

1.5 實時定量PCR

反應體系為20 μL，包括 10 μL 的2× SYBR buffer，1 μL的cDNA，正向、反向引物各1 μL，7 μL的水。反應程序為：94℃，1 min；94℃，30 sec，58℃，30 sec，40個循環(huán)；72℃，5 min。

所有qRT-PCR進行三次重復，以煙草內(nèi)源26s核糖體 RNA基因為內(nèi)參。內(nèi)參引物：26S-F 5' -GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3'；26S-R，5'- TCTCCCTTTAACACCAACGG-3'?；蛱禺愐铮篘tSAP5-qRT-F，5'-CCAAGGTCGCATATCCTCAT-3'；NtSAP5-qRT-R，5'-GCCGGTTAATCCTAGCTTCC-3'。2-ΔΔCT方法計算倍數(shù)變化，三次生物學重復計算±SD，Error bars為±SD（n = 3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtSAP5序列信息

在中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中查找到該基因ID為Ntab0877490.1，該基因與擬南芥中AtSAP5基因最為同源，因此將該基因命名為NtSAP5。設(shè)計特異引物通過克隆獲得NtSAP5的CDS編碼區(qū)，該片段大小為500 bp左右。通過測序發(fā)現(xiàn)煙草NtSAP5基因的CDS序列為474個堿基，編碼281個氨基酸，NtSAP5蛋白分子量為17513.94，等電點為9.5070。將其編碼CDS序列與基因區(qū)間序列比對，NtSAP5基因沒有內(nèi)含子。在NCBI網(wǎng)站上通過Blasp比對發(fā)現(xiàn)NtSAP5蛋白與絨毛煙草一個蛋白（NCBI登錄號為 XP_009631181）最為相似，氨基酸同源性達到97%。其次NtSAP5與栽培煙草中的一個蛋白（中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫基因ID為Ntab0779290）最為相似，氨基酸同源性達到93%。除了這兩個基因，NtSAP5與茄科番茄、馬鈴薯中的同源基因編碼蛋白的同源性較高，與水稻OSISAP1蛋白同源性較低，僅為60%。

分析NtSAP5蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)NtSAP5蛋白的N端與C端，在21-45、97-134氨基酸范圍內(nèi)分別編碼一個A20與AN1結(jié)構(gòu)域（圖1），該結(jié)構(gòu)域為一個鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合DNA的功能。

圖1 .NtSAP5蛋白結(jié)構(gòu)域注釋Fig.1 Functional domain annotation of NtSAP5

2.2 NtSAP5基因各煙草組織表達量及干旱誘導表達量

采用RT-PCR方法檢測NtSAP5基因在煙草根、葉片、莖、花、幼莢中的表達量，結(jié)果顯示，NtSAP5基因在煙草根中優(yōu)勢表達，在莖和葉中表達量較少，在花中表達量最低（圖2A）。干旱脅迫下的RT-PCR結(jié)果表明，NtSAP5基因在干旱脅迫處理1小時，2小時的時候表達量上調(diào)，而在干旱脅迫處理2小時后表達量下調(diào)（圖2B），圖2B的干旱脅迫方法采用的是空氣干燥脫水處理[7]，與采用停止?jié)菜幚砀珊禇l件下的基因表達結(jié)果趨勢一致，結(jié)果未附。

提取栽培煙草K326的RNA通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用特異引物克隆獲得NtSAP5基因的CDS片段，獲得500 bp左右的目的片段，片段大小符合預期。將該片段的測序結(jié)果在中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中進行Blastn比對，結(jié)果表明擴增序列與目的序列完全相同。將擴增得到的目的片段通過BP反應克隆到gateway pDONR-Zeo載體中。然后將在pDONR-Zeo載體中的目的片段經(jīng)過LR反應克隆到gateway過表達載體pG2BW7中。將構(gòu)建好的載體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，通過抗生素篩選獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。

采樣并提取轉(zhuǎn)基因陽性植株及非轉(zhuǎn)基因植株的RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用real-time PCR檢測基因的轉(zhuǎn)基因植株NtSAP15的表達量。收取表達量顯著增高的兩個轉(zhuǎn)基因植株的T0代種子，其中OE_1植株的NtSAP15的表達量比非轉(zhuǎn)基因植株表達量增加5倍，OE_2植株的NtSAP15的表達量比非轉(zhuǎn)基因植株標量上調(diào)27倍（圖3）。

圖2 NtSAP5基因煙草中各組織表達量及干旱脅迫表達量Fig.2 Expression of NtSAP5 gene in tobacco tissues and under drought stress

圖3 NtSAP5過表達植株基因表達量Fig.3 Transcript-level expression analysis of two NtSAP5 overexpression lines

將兩個獨立的轉(zhuǎn)基因T0代種子播種，分單株收獲T1代植株種子。將從不同T1轉(zhuǎn)基因株系收獲的種子播種在濃度為20mg/L的Basta平板上，挑選出萌發(fā)后存活超過98%的轉(zhuǎn)基因株系為轉(zhuǎn)基因純合株系。選取并種植純合轉(zhuǎn)基因株系及非轉(zhuǎn)基因煙草植株，待植株長到6-7葉期時，停止?jié)菜珊得{迫處理，干旱處理7天。圖4 為干旱脅迫處理7天NtSAP5過表達煙株與未轉(zhuǎn)基因煙株表型，包括干旱脅迫處理過表達轉(zhuǎn)基因植株OE_1、干旱脅迫處理過表達轉(zhuǎn)基因植株OE_2、干旱處理非轉(zhuǎn)基因煙草植株，其中OE_1、OE_2及非轉(zhuǎn)基因植株各選3株植株。結(jié)果表明經(jīng)過七天的干旱處理，過表達NtSAP5基因的煙草植株與非轉(zhuǎn)基因植株相比具有明顯的耐旱性，非轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯的干枯表型，而兩個獨立的NtSAP5轉(zhuǎn)基因株系葉片較為挺拔，尤其是OE_2轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)更強的耐旱性，這與OE_2株系中更高的NtSAP5表達量相吻合。

圖4 NtSAP5轉(zhuǎn)基因植株的抗旱表型Fig.4 Drought resistance phenotype of NtSAP5 transgenic lines

3 討論與結(jié)論

本研究通過同源克隆獲得了煙草中SAP5同源基因，將該基因命名為NtSAP5。通過克隆獲得栽培煙草NtSAP5序列，該基因CDS區(qū)域長度為474 bp，蛋白編碼長度為278 aa。NtSAP5基因沒有內(nèi)含子，其編碼蛋白在N端具有一個A20結(jié)構(gòu)域，在C端具有一個N1結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域都是較為保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，根據(jù)兩個鋅指結(jié)構(gòu)域的存在，可推斷該基因具有結(jié)合DNA的功能。水稻OSISAP1沒有已知的核定位信號，但定位在細胞核中[11]，擬南芥AtSAP5具有一個核定位信號且定位在細胞核內(nèi)。水稻OSISAP1能夠通過A20鋅指結(jié)構(gòu)域與其它SAP成員如RLCK253相結(jié)合[10]。NtSAP5與水稻的同源基因類似，沒有已知的核定位信號結(jié)構(gòu)域（NLS），NtSAP5可能通過與其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合被招募進細胞核內(nèi)，同時也不能排除存在未知的核定位信號進入細胞核的可能性。

轉(zhuǎn)錄因子是植物逆境應答信號通路早期信號轉(zhuǎn)導的重要成員。轉(zhuǎn)錄因子OSISAP1在水稻干旱脅迫下表達量先上升后下降，表明其在干旱的早期應答中發(fā)揮作用[12]。在本研究中，NtSAP5的干旱應答變化也出現(xiàn)先上升，而后緩慢下降，提示在NtSAP5同樣在煙草抗旱的早期反應中行使功能。NtSAP5在根與葉片中表達量較高，在花與幼莢中表達量低，表明該基因在煙草的營養(yǎng)生長器官及營養(yǎng)生長階段行使功能，該基因在根中的高量表達，提示該基因可能在在根對干旱響應中發(fā)揮作用，具體情況需要進一步的實驗驗證。

NtSAP5在栽培煙草K326中的過表達轉(zhuǎn)基因純合株系在干旱脅迫處理下，與對照相比具有明顯的耐旱性。這些結(jié)果驗證了該基因在煙草抗旱的生理過程中發(fā)揮功能。NtSAP5基因在擬南芥中的AtSAP5同源基因及水稻中的OSISAP1同源基因均能提高植物對干旱的抗性，但在茄科作物中，對該類基因的研究較少， NtSAP5基因增強煙草抗旱能力的結(jié)果，對SAP5等鋅指蛋白基因在茄科作物中功能的研究提供了初步的證據(jù)。

本研究從煙草中克隆到一個鋅指蛋白基因，命名為NtSAP5基因，其具有保守的A20與N1鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。NtSAP5基因在茄科的番茄及馬鈴薯中具有相應同源基因且同源性較高，在雙子葉擬南芥與單子葉水稻中也均有同源基因但同源性相對較低。該基因在干旱脅迫下的表達量變化及在栽培煙草K326中過表達所呈現(xiàn)出的抗旱表型，表明該基因參與煙草抗旱早期應答的調(diào)控過程且具有顯著增強煙草耐受干旱脅迫的功能。