李朋發(fā) ,楊龍,李桂龍 ,徐后娟,王玉軍,李忠佩
1 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京市北京東路71號(hào) 210008;
2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京市石景山區(qū)玉泉路19號(hào) 100049;
3 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,泰安市岱宗大街61號(hào) 271018
煙草土傳病害嚴(yán)重危害我國(guó)的煙葉生產(chǎn)[1]。目前,對(duì)煙草土傳病害的研究主要集中在三個(gè)方面,一是煙草病原菌的致病機(jī)理[2-4];二是植煙土壤微生物群落組成和多樣性[5-6];三是煙草病害的綜合防治措施[7-9]。而對(duì)于煙草土壤微生物群落功能的研究則鮮有報(bào)道。弄清煙草土壤微生物群落功能有助于深入了解煙草發(fā)病機(jī)理。
煙草根際土壤微生物種類(lèi)繁多,其中真菌是重要的組成部分。受限于技術(shù)手段,對(duì)煙草根際真菌群落的研究也基本上都集中在群落組成和多樣性上[10-11]。FUNGuild[12]是一個(gè)進(jìn)行真菌功能比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù),不僅可對(duì)真菌的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型進(jìn)行鑒定,還能對(duì)真菌進(jìn)行具體的功能分類(lèi)。FUNGuild在真菌群落研究中得到了較為廣泛的應(yīng)用[13-14]。本研究聯(lián)合使用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)和FUNGuild軟件,研究了鐮刀菌根腐病煙株與未發(fā)病煙株根際土壤真菌群落的組成和功能,旨在深入了解鐮刀菌根腐病發(fā)生的土壤微生物學(xué)機(jī)理,為鐮刀菌根腐病的控制提供科學(xué)參考。
采樣地位于山東省臨沂市沂水縣(35°97′N(xiāo),118°37′E),該地區(qū)年均氣溫為13.0℃,年均降水量875mm。樣地為坡地,坡頂為林地,坡中和坡底為多年撂荒的新墾煙地,土壤類(lèi)型為僵心棕堰土。坡中煙地中的煙株大規(guī)模發(fā)病,經(jīng)鑒定為鐮刀菌根腐病,平均發(fā)病率在95%以上。坡底煙地中的未見(jiàn)鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株。坡中土壤基本理化性質(zhì)為:pH 6.41,有機(jī)碳8.42 g·kg-1,總氮 0.89 g·kg-1,總磷0.96 g·kg-1,總鉀17.21 g·kg-1,堿解氮 86.65 mg·kg-1,速效磷83.38 mg.kg-1,速效鉀 103.17 mg·kg-1;坡底土壤基本理化性質(zhì)為:pH 6.38,有機(jī)碳8.46 g.kg-1,總氮 0.92 g·kg-1,總磷0.97 g·kg-1,總鉀17.34 g·kg-1,堿解氮 84.75 mg·kg-1,速效磷85.64 mg·kg-1,速效鉀 105.83 mg.kg-1。坡中與坡底土壤在理化性質(zhì)上無(wú)顯著差異。
在坡中、坡底各分別隨機(jī)選擇3塊煙地,每個(gè)地塊分別隨機(jī)選取5株煙株,取煙株根際土并將同一地塊采集的根際土混合。將采集好的土壤樣本加冰袋低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。將土樣分為兩部分,其中一部分立即放入-20℃冰箱保存,用于DNA提??;另一部分過(guò)2 mm篩并風(fēng)干,研磨后過(guò)0.149 mm篩,用于土壤理化性質(zhì)分析。
土壤DNA使用MP Fast?DNA試劑盒提?。∕P Biomedicals,CA,USA),提取方法參考試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。提取的DNA使用PowerClean?DNA Clean-up Kit(MoBio,CA,USA)進(jìn) 行 純化。DNA濃度和純度使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)檢測(cè),結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)純化的DNA濃度 均 在30 ng·μL-1以 上,OD260/OD280均 在1.8-2.0之間,濃度和純度均符合ITS擴(kuò)增要求。使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)的特異性引物(ITS1-F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA[15]/ ITS2-R:GCTGCGTTCTTCATCGATGC[16])對(duì)6個(gè)DNA樣本分別擴(kuò)增,PCR體系和條件參考Li的方法[17]。
使用Illumina MiSeq PE250測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Flash[18]和Trimmomatic[19]進(jìn)行拼接和質(zhì)控后,使用微生物生態(tài)學(xué)定量研究平臺(tái)(Quantitative Insights into Microbial Ecology ,QIIME)進(jìn)行處理。使用UCLUST[20]軟件對(duì)各序列在97%的相似性水平下聚類(lèi)操作分類(lèi)單位(operational taxonomic units,OTUs),各個(gè)OTU的代表序列使用UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)(https://unite.ut.ee/)進(jìn)行物種信息比對(duì)[21]。
真菌的營(yíng)養(yǎng)型、功能分組使用FUNGuild(1.0)軟件進(jìn)行比對(duì),大體步驟為:(1)將QIIME輸出的OTU表和物種信息表合并,將物種信息附加在OTU表的最后一列并命名為“taxonomy”;(2)將第(1)步得到的表格上傳到FUNGuild網(wǎng)站,開(kāi)始比對(duì);(3)比對(duì)完成后下載輸出結(jié)果到本地。輸出結(jié)果包含原始的OTU表并依據(jù)序列數(shù)量進(jìn)行排序。輸出結(jié)果還包含物種的分類(lèi)單位“Taxon”,物種分類(lèi)級(jí)別“Taxon Level”,營(yíng)養(yǎng)型“Trophic Mode”,功能分組“Guild”,可信度“Confidence”,生長(zhǎng)形態(tài)“Growth Morphology”,特征“Trait”,備注“Notes”和比對(duì)信息來(lái)源“Citation/Source”。
OTU數(shù)、OTU相對(duì)豐度等使用R語(yǔ)言(3.4.3)進(jìn)行聚類(lèi)計(jì)算,主坐標(biāo)分析(Principal coordinate analysis ,PCoA)、ANOSIM檢驗(yàn)也通過(guò)R語(yǔ)言(3.4.3)進(jìn)行。樣本的描述性分析、組間差異的顯著性分析使用SPSS 19.0中的獨(dú)立t檢驗(yàn)完成。所有圖片均通過(guò)Origin(9.1)制作。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為P<0.05。
經(jīng)過(guò)質(zhì)控,6個(gè)樣本共得到184,782條高質(zhì)量序列。在97%的相似性水平下聚類(lèi)OTU,每個(gè)樣本按照樣本最少序列數(shù)抽平到14,644條序列,6個(gè)樣本共聚類(lèi)得到600個(gè)OTU,其中有444條代表序列通過(guò)UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可鑒定為真菌。
在綱水平下對(duì)各樣本的物種進(jìn)行分類(lèi)求和,得到各樣本在綱水平下的物種組成,如圖1所示。通過(guò)圖1可以看出,未發(fā)?。℉)與鐮刀菌根腐病(S)煙株的根際真菌群落在物種組成上明顯不同。未發(fā)病煙株根際真菌群落中,散囊菌綱(Eurotiomycetes)為優(yōu)勢(shì)菌綱,平均占比為42.81%,糞殼菌綱(Sordariomycetes)次之,平均占比為13.97%。發(fā)病煙株根際真菌群落中則正好相反,糞殼菌綱(Sordariomycetes)平均占比為55.06%,糞殼菌綱(Sordariomycetes)平均占比為14.61%。發(fā)病煙株根際真菌群落中的傘菌綱(Agaricomycetes)和鳥(niǎo)綱菌綱(Orbiliomycetes)比例均顯著高于未發(fā)病煙株(P<0.05),但是座囊菌綱(Dothideomycetes)的相對(duì)豐度在兩組真菌群落中無(wú)顯著差異(P>0.05)。主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果顯示,未發(fā)病和發(fā)病煙株根際真菌群落顯著分異。進(jìn)一步通過(guò)ANOSIM檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),兩組煙株根際真菌群落的組間差異顯著大于組內(nèi)差異(P<0.05)。
圖1 未發(fā)?。℉)和鐮刀菌根腐病(S)煙株根際真菌群落在綱水平上的組成Fig.1 Composition of rhizospheric fungal community in group H (unaffected tobacco) and group S (Fusarium root rot diseased tobacco)
圖2 兩組煙株根際真菌群落組成的主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal coordinate analysis (PCoA) of rhizosphere fungal communities of group H and group S
分別選取Shannon-Wiener指數(shù)、Chao1指數(shù)和Observed OTUs指數(shù)描述兩組煙株根際真菌群落的多樣性,結(jié)果如表1所示,未發(fā)病組的三種α多樣性指數(shù)(Alpha diversities)均顯著高于鐮刀菌根腐病組(P<0.05),說(shuō)明未發(fā)病煙株根際真菌群落的多樣性顯著高于鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株。
表1 兩組煙株根際真菌群落多樣性對(duì)比Table 1 Comparison of Alpha diversities of rhizosphere fungal communities between group H and group S
根際FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果,對(duì)兩組煙株根際真菌的營(yíng)養(yǎng)型(trophic mode)進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖3所示,未發(fā)病煙株根際真菌的營(yíng)養(yǎng)型以腐生營(yíng)養(yǎng)型(saprotroph)為主,平均占比46.10%,病理營(yíng)養(yǎng)型(pathotroph)次之,平均占比22.85%;鐮刀菌根腐病煙株根際真菌的營(yíng)養(yǎng)型則以病理營(yíng)養(yǎng)型為主,平均占比54.64%,腐生營(yíng)養(yǎng)型次之,平均占比12.88%。兩組煙株根際的病理營(yíng)養(yǎng)型真菌和腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌的相對(duì)豐度均具有顯著性差異(P<0.05)。兩組煙株根際的共生營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度均不足1%,但是未發(fā)病煙株根際的共生營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度顯著低于鐮刀菌根腐病煙株(P<0.05)。另外,未發(fā)病煙株根際有相對(duì)更多的真菌營(yíng)養(yǎng)型尚未鑒別。
圖3 兩組煙株根際真菌群落的營(yíng)養(yǎng)型組成Fig.3 Trophic composition of rhizosphere fungi communities of group H and group S
在600個(gè)OTU中,共有21個(gè)OTU經(jīng)FUNGuild鑒定為植物病原菌(Plant pathogen),其中有6個(gè)OTU的鑒定結(jié)果可信度(Confidence Ranking)為“Possible”,因此僅對(duì)剩余15個(gè)鑒定結(jié)果可信度為“Probable”和“Highly probable”的高可信病原菌OTU進(jìn)行分析。
15個(gè)高可信度的病原菌OTU分別來(lái)自12個(gè)菌屬,其中,鐮刀菌屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)和青霉菌屬(Penicillium)均有2個(gè)OTU被鑒定為高可信病原菌且鐮刀菌屬的兩個(gè)OTU均為腐皮鐮孢菌(F.solina),其它9個(gè)菌屬均僅有1個(gè)OTU被鑒定為高可信病原菌。在所有高可信病原真菌中,鐮刀菌占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。在未發(fā)病組中,2個(gè)鐮刀菌OTU的序列數(shù)占病原菌序列總數(shù)的75.02%±10.67%,而在鐮刀菌根腐病組中,2個(gè)鐮刀菌OTU的序列數(shù)占病原菌序列總數(shù)的99.10%±0.80%。鐮刀菌根腐病煙株根際的鐮刀菌在序列數(shù)和相對(duì)豐度上均顯著高于未發(fā)病組(P<0.05)。對(duì)兩組煙株根際高可信病原菌OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖4所示。未發(fā)病煙株根際病原真菌相對(duì)豐度平均為1.12%,而鐮刀菌根腐病煙株根際病原真菌相對(duì)豐度則高達(dá)30.73%,差異顯著(P<0.05)。
圖4 兩組煙株根際病原菌相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of rhizospheric pathogens of two groups
根際微生物區(qū)系被稱(chēng)為植物的第二基因組,對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有決定性的影響[22]。本研究分析了鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株與未發(fā)病煙株根際土壤的ITS測(cè)序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)兩種根際土壤的真菌群落組成有顯著差異,未發(fā)病煙株根際真菌多樣性顯著高于發(fā)病煙株,這與李小龍等對(duì)青枯病煙株根際真菌群落的研究結(jié)果相吻合[23]。鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株根際真菌群落多樣性的降低,很可能是鐮刀菌在群落的種間競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì),少數(shù)病原菌不斷積累并逐漸成為優(yōu)勢(shì)種,在這個(gè)過(guò)程中,相應(yīng)的部分有益菌因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)能力弱而被淘汰[24],物種數(shù)減少,多樣性降低。
除群落組成和多樣性外,鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株與未發(fā)病煙株根際真菌的營(yíng)養(yǎng)型組成也存在顯著差異。在未發(fā)病煙株根際,真菌以腐生營(yíng)養(yǎng)型為主,病理營(yíng)養(yǎng)型次之,而發(fā)病煙株根際真菌的營(yíng)養(yǎng)型則以病理營(yíng)養(yǎng)型為主,腐生營(yíng)養(yǎng)型次之。病理營(yíng)養(yǎng)型表示真菌通過(guò)傷害寄主細(xì)胞來(lái)獲取自身所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而腐生營(yíng)養(yǎng)型則表示真菌通過(guò)分解死亡的寄主細(xì)胞來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[25]。鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株根際的病理營(yíng)養(yǎng)型真菌顯著高于未發(fā)病植株,說(shuō)明發(fā)病植株根際可能有更多的致病真菌,尤其是鐮刀菌,通過(guò)破壞根系細(xì)胞來(lái)維持自身生長(zhǎng),導(dǎo)致煙株根系組織遭到破壞,進(jìn)而使病原菌能更加順利地從根系對(duì)煙株進(jìn)行侵染,最終導(dǎo)致煙株發(fā)病。
分析結(jié)果顯示,發(fā)病煙株根際的病原菌相對(duì)豐度也顯著高于未發(fā)病煙株,2個(gè)鐮刀菌在發(fā)病煙株根際的病原菌中占據(jù)絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)地位。鐮刀菌是煙草致病菌,可引發(fā)煙草的鐮刀菌根腐病[26]。其中,尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、茄病鐮刀菌(F.solani)等是侵染煙草根系并引發(fā)根腐病的主要病原菌種[26-27],主要通過(guò)傷害煙草的維管束組織和根系組織等來(lái)侵染煙草[27]。因此,聯(lián)合使用高通量測(cè)序與FUNGuild軟件,可以對(duì)土傳病害感病煙株的根際優(yōu)勢(shì)病原真菌群落進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定,同時(shí)也可提供豐富的、非優(yōu)勢(shì)的潛在病原真菌信息,這對(duì)揭示煙草土傳病害發(fā)生的土壤微生物學(xué)機(jī)理具有重要意義,也可為煙草土傳病害的防控提供科學(xué)參考。
通過(guò)高通量測(cè)序與FUNGuild的聯(lián)合使用,對(duì)鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株與未發(fā)病煙株根際土壤中的真菌群落進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:(1)未發(fā)病煙株與發(fā)病煙株根際的真菌群落在組成上具有顯著差異,未發(fā)病煙株根際真菌多樣性顯著高于發(fā)病煙株;(2)發(fā)病煙株根際真菌的營(yíng)養(yǎng)型以病理營(yíng)養(yǎng)型為主,腐生營(yíng)養(yǎng)型次之,而未發(fā)病煙株則正好相反;(3)發(fā)病煙株根際的病原菌相對(duì)豐度顯著高于未發(fā)病煙株,鐮刀菌在病原菌群落中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。高通量測(cè)序與FUNGuild的聯(lián)用,可以對(duì)土傳病害感病煙株的根際優(yōu)勢(shì)病原真菌群落進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定,也可為煙草土傳病害的防控提供科學(xué)參考。