印度梨形孢液體發(fā)酵產(chǎn)物的制備及其在日本青蔥上的應(yīng)用

劉慧春，朱開元，張加強，譚晨，周江華，李明江，田丹青

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究開發(fā)中心，浙江 杭州 311202)

印度梨形孢(Piriformosporaindica)是印度科學(xué)家Verma等[1]于1998年在印度西北部的塔爾沙漠中發(fā)現(xiàn)的一種新生物菌，該菌能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)[2]，且寄主廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢可定殖于多種作物的根部，如擬南芥、煙草、大麥、小麥、玉米等[3-7]，甚至能夠在叢枝菌根真菌(AMF)不能定殖的十字花科作物上定殖[8]，故可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)上。研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢能促進植物生長，加快植物對氮、磷等礦物質(zhì)的吸收，提高大麥、小麥等糧食作物產(chǎn)量[9-12]。因此，印度梨形孢真菌被認(rèn)為是一種生物防治因子和土壤改良因子，具有廣闊的科研和商業(yè)開發(fā)前景。

印度梨形孢的培養(yǎng)通常采用的是Kafer培養(yǎng)基[13]，但卻適合于實驗室小型試驗階段，由于生長速度較慢，不能滿足生產(chǎn)上大批量定期定量對印度梨形孢生物菌肥的需求，因此需要通過有效手段來促進印度梨形孢的液體培養(yǎng)產(chǎn)量，同時提高代謝物的作用。本研究采用不同的培養(yǎng)基配方，并在印度梨形孢特定的發(fā)酵階段加入不同來源的冷激蛋白和不同外源物，研究不同培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法對提高印度梨形孢發(fā)酵產(chǎn)物的效果，并將獲得的印度梨形孢發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于蔬菜日本青蔥的育苗階段，研究了印度梨形孢對日本青蔥的促生增產(chǎn)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試材為日本青蔥，生長于浙江省杭州市蕭山區(qū)舒蘭農(nóng)業(yè)有限公司臨江工業(yè)園蔬菜種植基地；供試菌株為印度梨形孢，由臺灣大學(xué)葉開溫教授惠贈；冷激蛋白的來源有3種菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，由浙江省林科院提供。

1.2 培養(yǎng)基配方

PDA平板培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，用水定容至1 000 mL，自然pH，在121 ℃下滅菌20 min。

液體種子培養(yǎng)基。葡萄糖5～20 g，酵母粉4 g，蛋白胨3 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，定容至1 000 mL，自然pH，在121 ℃下滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基。玉米粉0.3%～0.9%，牛肉浸膏0.1%～0.6%，K2HPO40.10%～0.25%，MgSO40.05%～0.15%以及余量的水，自然pH，在121 ℃下滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖15 g，玉米粉4 g，牛肉浸膏3 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.55 g，定容至1 000 mL，自然pH，在121 ℃下滅菌20 min。

1.3 印度梨形孢的活化培養(yǎng)

將斜面保藏的印度梨形孢菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，在22～28 ℃下活化培養(yǎng)4～15 d，獲得活化后的印度梨形孢菌種。

1.4 冷激蛋白的制備

將冷激蛋白的3種來源的菌株從37 ℃降至15 ℃分別培養(yǎng)1、12和20 min，將菌體放入勻漿機中，在60 MPa下勻漿2次，加入占菌體質(zhì)量1%～3%的木瓜蛋白酶，在40～50 ℃下酶解1 h，3～5 ℃下12 000 rpm離心20 min，收集上清液；上清液采用截留分子質(zhì)量為2～5 kD膜超濾，截留液調(diào)pH至5.0，過夜，12 000 rpm離心20 min，將離心上清液真空冷凍干燥得到蛋白樣品，將其溶于0.02 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中配成20 mg·mL-1溶液，上樣于葡聚糖凝膠過濾柱Sephadex G-25，用0.01 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗脫，流速0.5 mL·min-1，每管收集2 mL，自動收集洗脫液并于紫外280 nm檢測并收集組分，通過真空冷凍干燥得到來源于不同菌株的冷激蛋白。

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物的制備

1.5.1 液體種子液

取1～3 cm2大小活化后的印度梨形孢菌種接種于1 L液體種子培養(yǎng)基中，在22～24 ℃培養(yǎng)1～9 d，得到印度梨形孢液體種子液。

1.5.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)

將1.5.1中印度梨形孢液體種子液按占固體培養(yǎng)基體積5%～15%的用量接入添加有外源物的固體培養(yǎng)基中，在18～28 ℃下培養(yǎng)1～15 d后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍干燥、粉碎后得外源物固體發(fā)酵培養(yǎng)物；外源物分為3種：生地和梔子經(jīng)粉碎后得到的生地小塊和梔子小塊、生地經(jīng)粉碎后得到的生地小顆粒、梔子粉碎后的梔子粉末；每升固體培養(yǎng)基中添加不同量的外源物。

1.5.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)

將1.5.1中印度梨形孢液體種子液按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積3%～12%的量接種于添加有外源物固體發(fā)酵培養(yǎng)物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在18～28 ℃下培養(yǎng)1～5 d后加入不同來源的冷激蛋白，然后調(diào)整溫度在15～25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1、5和12 d，終止發(fā)酵后，得到印度梨形孢發(fā)酵產(chǎn)物。液體發(fā)酵培養(yǎng)基中外源物固體發(fā)酵培養(yǎng)物的添加量為0.8～9.0 g·L-1，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中冷激蛋白的添加量為0.2～5.0 mg·mL-1。

1.6 生物量測定

對照和處理各3個重復(fù)，每個重復(fù)取1 L印度梨形孢的發(fā)酵產(chǎn)物進行過濾，將過濾后的菌絲體瀝干后稱重，獲得的菌絲體重量即為印度梨形孢發(fā)酵產(chǎn)物的生物量(g·L-1)，最后取平均值。

1.7 發(fā)酵產(chǎn)物在日本青蔥上的施用

將印度梨形孢發(fā)酵產(chǎn)物進行過濾、瀝干并稱重，稱取3 g菌絲體加入到盛有500 mL水的榨汁機中，炸碎直至肉眼看不到絮狀菌絲體，然后定容至1 L。稀釋10倍后噴施到日本青蔥幼苗上，以噴施清水作為對照，每周噴施1次，2個月后調(diào)查統(tǒng)計日本青蔥的蔥管數(shù)、株高、根系數(shù)、鮮重、干重等各項形態(tài)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方和制備方法對印度梨形孢生物量的影響

將不同的培養(yǎng)基配方和制備方法獲得的印度梨形孢發(fā)酵產(chǎn)物進行生物量測定，獲得如表1的結(jié)果。

從表1可以看出，與常規(guī)培養(yǎng)方法(對照)相比，采用本研究方法(處理)發(fā)酵培養(yǎng)的印度梨形孢生物量分別提高56.0%、81.5%、66.9%、59.5%和80.0%，均達到極顯著差異。在本研究制備方法限定的范圍內(nèi)，各參數(shù)的變化并不影響印度梨形孢液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高，因此本研究制備方法中任意參數(shù)的組合均可實現(xiàn)印度梨形孢液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高，其中尤以處理2效果最好，在生物量提高的同時，其生長周期縮短24 d。

2.2 印度梨形孢發(fā)酵產(chǎn)物對日本青蔥生長的影響

以處理2的培養(yǎng)基配方和制備方法，培養(yǎng)和制備印度梨形孢的發(fā)酵產(chǎn)物，并將獲得的印度梨形孢菌體經(jīng)炸碎、稀釋后，噴施到日本青蔥的幼苗上。從蔥播種后1周開始噴施，每周施用1次，2個月為1個周期，其他正常管理，以清水作為對照。噴施8次后，從田間隨機取樣，對照和處理各取2組，每組30株，進行調(diào)查，調(diào)查指標(biāo)包括株高、莖干直徑、蔥管數(shù)、根系數(shù)、根系長、鮮重和干重等。

從圖1可以看出，印度梨形孢能夠明顯促進日本青蔥的營養(yǎng)生長，與對照相比，無論是株高、莖干直徑還是蔥管數(shù)都得到明顯提高。

表1 不同培養(yǎng)基配方及制備方法下印度梨形孢的生物量

注：1：PDA培養(yǎng)基；2：液體種子培養(yǎng)基；3：固體培養(yǎng)基；4：液體種子液；5：固體發(fā)酵；6：液體發(fā)酵；7：生物量測定。

A，經(jīng)粉碎后得到的生地小塊；B，粉碎后的梔子小塊；C，粉碎后的生地小顆粒；D，粉碎后的梔子粉末；E，粉碎后的生地糊；F，粉碎后的梔子糊。a，枯草芽孢桿菌；b，大腸桿菌；c，嗜熱鏈球菌。

圖1 印度梨形孢對日本青蔥生長的影響

從表2也可以更加明確地看出，噴施過印度梨形孢的日本青蔥各項生長指標(biāo)均比對照高，其中株高分別比對照高出5.8%和16.9%，莖干直徑分別比對照高出16.1%和34.3%，蔥管數(shù)分別比對照高出32.4%和43.3%，根系長分別比對照高出6.9%和7.0%，根系數(shù)分別比對照高出20.2%和22.7%。

噴施印度梨形孢能明顯提高日本青蔥的產(chǎn)量(表3)，單株鮮重和30株鮮重分別比對照要高出51%和43%，每667 m2最高可增產(chǎn)600 kg。

表2 印度梨形孢對日本青蔥生長指標(biāo)的影響

表3 印度梨形孢對日本青蔥產(chǎn)量的影響

3 討論

來源于沙漠的印度梨形孢是具有多種生物功能的內(nèi)生真菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有潛在的應(yīng)用價值。印度梨形孢最經(jīng)典的培養(yǎng)基是Kafer培養(yǎng)基，然而印度梨形孢在該培養(yǎng)基上生長速度較慢，并不能滿足生產(chǎn)上大批量定期定量的對印度梨形孢的需求。為了提高印度梨形孢的生長速度，急需對其培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進行優(yōu)選和改良。有研究通過在Kafer培養(yǎng)基中加入蛋白胨和酵母提取物等來提高印度梨形孢的生物量[14]。另外，碳源對印度梨形孢的生長也非常重要，一般利用多糖作為碳源，其中葡萄糖為最佳碳源[15]。本研究以葡萄糖作為碳源，并在培養(yǎng)基中加入蛋白胨、酵母粉和牛肉浸膏等附加物，促進印度梨形孢的生長速度。

冷激蛋白(cold shock domain proteins，CSPs)是廣泛存在于生物體中的一種應(yīng)激蛋白，在細(xì)菌、植物與動物中均有發(fā)現(xiàn)，是一類高度保守的核酸結(jié)合蛋白，其通過RNA分子伴侶活性參與轉(zhuǎn)錄、翻譯、生長發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答等細(xì)胞生理活動，從而達到一定的細(xì)胞增殖作用[16]。本研究根據(jù)印度梨形孢代謝產(chǎn)物合成代謝途徑的特點，利用生地、梔子中的有效成分，經(jīng)印度梨形孢固體發(fā)酵和液體發(fā)酵工藝，并在特定的發(fā)酵階段添加冷激蛋白，一方面提高了印度梨形孢的生物量，另一方面縮短了印度梨形孢的制備周期，相比常規(guī)法，其生物量提高55.99%～81.51%，生長周期縮短12～26 d。

Verma等[17]報道，印度梨形孢對寄主植物玉米、煙草等均有促生作用。近幾年，也有關(guān)于印度梨形孢對農(nóng)作物產(chǎn)生促生增產(chǎn)作用的報道。例如印度梨形孢能夠定殖于小白菜、水稻、油菜等農(nóng)作物[18-20]，促進這些作物的生長，并達到增產(chǎn)的效果。究其原因，可能是由于印度梨形孢定殖于植物根系后，能夠調(diào)節(jié)寄主植物根系內(nèi)源激素如GA含量的增加，進而促進根系的生長，根系生長旺盛了，對營養(yǎng)的吸收加強、對逆境的抵抗力也增強，從而起到促進植物生長并達到增產(chǎn)的作用。印度梨形孢自身也能產(chǎn)生分泌物質(zhì)，如A-淀粉酶和蛋白酶，這些分泌物質(zhì)能夠促進植物的生長[14]。本研究印度梨形孢的發(fā)酵產(chǎn)物中，也有其分泌的激素和蛋白，這些均可能是促進日本青蔥營養(yǎng)生長的有益物質(zhì)，具體有待進一步展開深入的研究。