大腦中動脈阻斷模型大鼠血漿差異蛋白篩選及其生物信息學(xué)分析

腦梗死(cerebral infarction，CI)又稱缺血性腦卒中，屬于中醫(yī)“中風(fēng)”的范疇。因具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點(diǎn)，而一直備受人們關(guān)注。其發(fā)生發(fā)展與蛋白質(zhì)調(diào)控、基因表達(dá)、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子和體內(nèi)微環(huán)境等諸多因素密切相關(guān)，各因素相互影響、相互作用，發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜。當(dāng)前圍繞腦梗死發(fā)病機(jī)制所做的多數(shù)研究是通過檢測某一生化指標(biāo)用以了解 CI病理生理狀況，研究內(nèi)容較單一，沒有形成系統(tǒng)研究，難以全面闡明 CI的發(fā)病機(jī)制。目前針對CI的治療，多以西醫(yī)療法為主，主要包括溶栓、抗凝、降纖以及腦保護(hù)為主的治療手段；其中血管內(nèi)治療也是一種行之有效的急性缺血性的治療方式[1]。中醫(yī)藥對于治療 CI有其獨(dú)特的優(yōu)勢，近年研究已證實(shí)多種中藥具有改善腦血流、舒張腦血管、防止缺血性再灌注損傷、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等作用，同時中藥也有一定抗凝、溶栓、降脂、防止動脈粥樣硬化的作用[2-4]。因此闡明CI發(fā)生發(fā)展過程的機(jī)制，研究并發(fā)現(xiàn)相關(guān)特異蛋白，明確其相互作用機(jī)制可為治療和用藥提供依據(jù)。

《丹溪心法》認(rèn)為：“有諸于內(nèi)，必行諸于外”，醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為功能和結(jié)構(gòu)是統(tǒng)一的，一定的結(jié)構(gòu)往往對應(yīng)于特定的生理功能。蛋白質(zhì)是物質(zhì)生命的承擔(dān)者，也是生命活動的執(zhí)行者，基于蛋白質(zhì)的研究有利于人

們進(jìn)一步認(rèn)識疾病的生理病理機(jī)制，促進(jìn)對疾病的診斷和治療。從人類基因組測序到后基因組時代，就CI產(chǎn)生后單一物質(zhì)的研究比較多，對于蛋白質(zhì)作用的系統(tǒng)研究較少。疾病的病理生理過程往往不是單一的，而是一個相互作用的、復(fù)雜的調(diào)控過程，包括基因的調(diào)控、基因表達(dá)的調(diào)控、蛋白質(zhì)的調(diào)控、蛋白修飾的調(diào)控等等。因此在研究時不僅需要明確某物質(zhì)的作用，同時還要明確各物質(zhì)之間的相互聯(lián)系[5]。正如中醫(yī)的整體觀念所提倡，人體的五臟六腑是一個相互聯(lián)系的統(tǒng)一體，通過經(jīng)絡(luò)、氣血津液、臟腑等相互聯(lián)系、相互作用，維持人體的正常生命活動；對于疾病的病理生理及診斷治療當(dāng)然也需要系統(tǒng)全面地進(jìn)行考慮。本研究將探索CI的發(fā)生機(jī)制，預(yù)測和評價(jià)CI相應(yīng)的治療手段，為腦梗死的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SD雄性大鼠，SPF級，體重250～300 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。保持溫度在25 ℃、空氣濕度60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分組為腦梗死組和假手術(shù)組，每組32只。

1.2 試劑與儀器 Ⅱ[Amersham(美國)]， PowerLook 2100XL [UMAX(美國)]， Protean Ⅱ Xi cell、IPG gel strip、pH3～10兩性電解質(zhì)[Bio-Rad(美國)]， 4000 Series software軟件 、 GPS Explorer v3.5軟件、4700 Proteomics Analyzer (ABI)、 CHAPS、DTT、PMSF、碘乙酰胺(IAA)[Sigma(美國)]， 尿素(上海生工)， 硫脲 (天津市化學(xué)試劑一廠)，乙腈CAN Fisher， 三氟乙酸TFA (DIMA)， Trypsin Gold Promega， 基質(zhì)CHCA 、碳酸氫銨(Fluka)，其他為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 首先配制10%的水合氯醛溶液，然后按0.35 mL/100 g體重腹腔注射麻醉大鼠，固定于鼠板上，采用改進(jìn)的Zea Longa[6]腔內(nèi)栓線阻斷法，將腦梗死組和假手術(shù)組大鼠阻斷大腦中動脈(MCAO)的血供來源。模型制備3 h后參照Longa方法進(jìn)行5分制神經(jīng)功能評分，0分：無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分：不能完全伸展右前肢；2分：向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時向右側(cè)傾倒；4分：不能自行行走。評分為1～3分者為模型制備成功，余者剔除。不足預(yù)定數(shù)額者按照隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動物并重新造模。手術(shù)前1 d晚禁食不禁水，在手術(shù)后每次每組隨機(jī)取8只大鼠，每組分4次進(jìn)行采血。

1.3.2 血漿制備 用3.8%的枸櫞酸鈉抗凝采血管取血，采集完血后立即將試管蓋上顛倒混勻，讓抗凝劑與血充分混合。以3 000 r/min離心10 min吸取上清液(血漿)進(jìn)行分裝，置-80 ℃冰箱備用。

1.3.3 雙向電泳樣品的制備 每組樣品等量混合，6 000 r/min 4 ℃ 離心10 min，取上清。取高密度蛋白柱去除樣品中的高密度蛋白；然后用bradford法測量濃度，將已知濃度的樣品，標(biāo)記后于-80 ℃ 保存。

1.3.4 二維凝膠電泳 用IPG預(yù)制膠條，進(jìn)行一向等電聚焦；聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡、再進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳；用12%丙烯酰胺凝膠，平衡膠條后進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，進(jìn)行染色；將染色后的凝膠浸于脫色液中，水平搖床振蕩脫色。最后換成超純水再洗滌30 min，進(jìn)行掃描，用300DPI透射掃描。

1.3.5 質(zhì)譜分析 清洗樣品板，校正儀器標(biāo)準(zhǔn)品的配制、點(diǎn)樣、檢測；打開測試未知樣品的采集方法和處理模式，進(jìn)行樣品分析。選用正離子反射模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。

檢索：打開GPS軟件→新建一個project→選擇Gel mode→選擇一個spotset→新建一次檢索→選擇MS或MSMS→選擇數(shù)據(jù)庫：NCBI(nr)非冗余數(shù)據(jù)庫、Swissprot數(shù)據(jù)庫，選擇參數(shù)、 檢索鑒定差異蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 假手術(shù)組與腦梗死組血漿膠圖掃描結(jié)果比較 度值結(jié)果顯示：有6個差異蛋白點(diǎn)，腦梗死組血漿中的1個蛋白質(zhì)(肽)在假手術(shù)組血漿中不存在，有1個蛋白質(zhì)(肽)只在假手術(shù)組血漿中有；另外有1個蛋白質(zhì)(肽)在腦梗死組血漿中比在假手術(shù)組血漿中明顯減少，有3個蛋白質(zhì)(肽)在腦梗死組血漿中比在假手術(shù)組血漿中明顯增加。詳見表1、圖1、圖2。

表1 6個血漿差異蛋白點(diǎn)在腦梗死組與假手術(shù)組灰度值比較(±s)

圖1 假手術(shù)組血漿膠圖掃描結(jié)果

圖2 腦梗死組血漿膠圖掃描結(jié)果

2.2 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜分析 在數(shù)據(jù)庫(NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫、 Swissprot數(shù)據(jù)庫)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，每個篩選出的蛋白(肽)有10個檢索結(jié)果，表格中 Total Ion Score C.I.(二級)或Protein Score C.I.(一級)列數(shù)值達(dá)到95%以上即可認(rèn)為鑒定成功。在本次選取進(jìn)行分析的6個蛋白點(diǎn)中，5個鑒定出可能與之相對應(yīng)蛋白。鑒定出的蛋白質(zhì)登錄號及名稱為：3409蛋白的NCBI登錄號：gi|758263，α-1主要急性期蛋白；4213號蛋白Swissprot登錄號：sp|P01835，Ig kappa鏈；5214蛋白的NCBI登錄號：gi|158186621，補(bǔ)體C4；5301蛋白的NCBI登錄號：gi|47682636，胎球蛋白；5304蛋白的NCBI登錄號：gi|144922622，纖維蛋白原α鏈；編號5404號蛋白NCBI登錄號：gi|55628，對應(yīng)為未命名蛋白。

2.3 生物信息學(xué)分析 將選出的差異蛋白編號轉(zhuǎn)換為 Uniprot ID，然后將6個差異蛋白 ID號輸入OmicsBean在線分析平臺，得到相應(yīng)的生物信息分析結(jié)果(見圖3)，顯示涉及的生物學(xué)過程有175個，其中具有顯著意義的96個；涉及細(xì)胞組分17個，其中6個具有較顯著意義；涉及分子功能36個，有20個有較顯著意義；涉及差異蛋白KEGG通路4個，其中與腦缺血密切相關(guān)的補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路1條。詳見圖4。

圖3 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜分析

圖4 補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路

3 討 論

從研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)與腦梗死密切相關(guān)的一個通路——補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路，補(bǔ)體 C4，是該通路中間的物質(zhì)，存在于補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑和凝集素途徑中，是補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑中一個重要調(diào)節(jié)蛋白，控制著補(bǔ)體C3與補(bǔ)體C5轉(zhuǎn)化酶合成與活性。能與周圍的內(nèi)皮細(xì)胞共價(jià)結(jié)合，是比較穩(wěn)定的組分，可結(jié)合于血小板的表面，影響血小板的聚集及血小板與循環(huán)的白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用[7]。有研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注腦組織梗死區(qū)域有補(bǔ)體 C4的沉積，而且隨著補(bǔ)體沉積的增加呈現(xiàn)出損傷逐漸加重，沉積減少，則損傷也有所減輕，說明腦缺血損傷過程有補(bǔ)體系統(tǒng)的激活[8]。補(bǔ)體 C4 可以中和病毒的生物學(xué)活性，甚至直接中和RNA腫瘤病毒[9]。本研究中腦梗死模型大鼠血漿中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C4的存在，進(jìn)一步證實(shí)腦梗死的發(fā)生過程有補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，并由此級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的損傷作用。

血漿中纖維蛋白原(Fbg)為另一參與補(bǔ)體凝血級聯(lián)通路的差異蛋白，是血漿中分子量最大的糖蛋白，又稱凝血因子Ⅰ，是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，是纖維蛋白的前體，是內(nèi)源性和外源性凝血途徑中的共同因子。纖維蛋白原由α、β、γ 三對不同多肽鏈組成。纖維蛋白原在體內(nèi)主要參與止血、凝血過程，在血液中凝血酶的作用下，將形成纖維蛋白單體，隨后自發(fā)性聚集并與凝血因子 Ⅻa相互作用；有與血小板糖蛋白相連接的特異性結(jié)構(gòu)，可以促進(jìn)血小板發(fā)生聚集；此外纖維蛋白原還有與纖溶酶結(jié)合部位、與Ca2+結(jié)合部位、與組織纖溶酶原激活物 (t-PA)等分子的結(jié)合部位。在臨床上也發(fā)現(xiàn)影響到纖維蛋白原相應(yīng)的功能，會有出血、血栓形成或者其他一些癥狀發(fā)生[10]。Fbg是血漿中含量最高的凝血因子，可以影響血液黏度，血中濃度過高是心、腦血管病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素[11]；也是一種急性時相蛋白，可以直接破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其通透性增加；當(dāng)血漿纖維蛋白原沉積于血管壁，會加速動脈粥樣硬化，促使血管內(nèi)微血栓形成[12]。研究表明高Fbg不僅是炎癥和心血管或腦血管疾病的標(biāo)志物，而且還能用來判斷疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)展，特別是伴隨有血管神經(jīng)功能障礙的情況[13]。本研究結(jié)果顯示，在腦梗死模型大鼠血漿中Fbg下調(diào)，說明Fbg更多變成纖維蛋白沉積于血管壁損傷內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步加重缺血性損傷。

胎球蛋白不參與凝血途徑，它是由肝臟分泌的雙向急性時相蛋白，可參與炎癥反應(yīng)，以及對異位鈣化具有強(qiáng)烈的抑制作用，可以減輕異位鈣化和骨質(zhì)疏松[14]；血管鈣化是動脈粥樣硬化及不穩(wěn)定性斑塊的標(biāo)志，是導(dǎo)致其心血管疾病發(fā)生及死亡的重要原因，其中胎球蛋白A(又稱α2-HS-糖蛋白)的存在可能改善血管的粥樣硬化；在急性缺血性卒中時病人血清胎球蛋白增高， 考慮與其促炎作用相關(guān)，但在動物實(shí)驗(yàn)中，其對缺血腦組織具有保護(hù)作用。胎球蛋白還可能參與亞臨床炎癥， 作為 AD 進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志。胎球蛋白A可作為多發(fā)性硬化癥病程分類的一項(xiàng)依據(jù)，以及療效判斷的一種手段[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，胎球蛋白A被認(rèn)為是導(dǎo)致胰島素抵抗的物質(zhì)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)胎球蛋白在腦梗死大鼠血漿中較假手術(shù)組增加，說明可能胎球蛋白是機(jī)體自身對抗腦缺血起保護(hù)作用的物質(zhì)，具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上分析，差異明顯的幾個蛋白、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路是腦缺血損傷發(fā)生的關(guān)鍵過程，從這個通路著手可能有助于闡明腦梗死發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，也可能發(fā)現(xiàn)藥物治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)；另外這條通路的下游通路可能也是影響腦梗死關(guān)鍵點(diǎn)。當(dāng)然腦梗死是一個復(fù)雜的病理過程，一定還有其他蛋白和調(diào)控機(jī)制作用，仍有待進(jìn)一步的深入研究。