富氫鹽水對(duì)大鼠腸缺血再灌注凝血功能的影響

范 馨，杜 娟，楊 博，周 軍

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，四川瀘州 646000）

機(jī)體凝血功能受到促凝系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的共同調(diào)節(jié)，生理狀態(tài)下三大系統(tǒng)協(xié)調(diào)工作，維持凝血功能穩(wěn)定，不會(huì)形成血栓或者出現(xiàn)出血傾向。當(dāng)機(jī)體面臨炎癥打擊、缺血缺氧、酸中毒、細(xì)菌病毒感染等情況時(shí)，凝血功能出現(xiàn)異常，誘發(fā)出血或血栓形成，可能出現(xiàn)DIC、MODS等嚴(yán)重后果[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注會(huì)損傷腸、肝、腎、腦、肺等器官乃至出現(xiàn)全身多器官功能衰竭[4]，還會(huì)激活凝血系統(tǒng)[5]，而對(duì)于腸缺血再灌注后凝血功能的具體變化鮮有研究。近年來(lái)，關(guān)于氫氣和富氫鹽水的研究涉及到各種疾病，它對(duì)缺血再灌注、膿毒血癥、糖尿病、肝性腦病、癡呆、急性肺損傷等均有治療作用，能顯著減弱腸缺血再灌注對(duì)器官組織的傷害，保護(hù)器官功能[6-10]。但關(guān)于富氫鹽水對(duì)大鼠腸缺血再灌注后凝血功能的影響少有報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腸缺血再灌注模型，予以富氫鹽水干預(yù)，觀察大鼠凝血功能變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與器材

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)成年雄性SD大鼠32只，體重220～250 g，許可證號(hào)為SYXK（川）2018-065，所有操作均經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查并同意。主要實(shí)驗(yàn)試劑與器材：1∶9枸櫞酸鈉抗凝管，全自動(dòng)凝血儀Stago-evolution（北京斯塔高公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），富氫鹽水（青島泛潤(rùn)經(jīng)貿(mào)有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將32只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只：生理鹽水對(duì)照組（C組），富氫鹽水對(duì)照組（H組），腸缺血再灌注組（R組），富氫鹽水處理組（R+H組）。

1.3 造模取材

造模參照本課題組既往研究[11]，如在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇大鼠造模失敗或意外死亡，則補(bǔ)足大鼠后再行造模。大鼠造模前禁食12 h，自由飲水。稱重后經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉。備皮消毒，在劍突下1 cm處，沿腹正中線開(kāi)腹，尋找腸系膜上動(dòng)脈（SMA）并充分暴露。C組和H組僅暴露SMA不夾閉，R組和R+H組用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉SMA。R組和R+H組在腸缺血持續(xù)90 min后，再次開(kāi)腹，松開(kāi)動(dòng)脈夾，恢復(fù)血供，造成缺血后再灌注。在再灌注開(kāi)始前10 min經(jīng)尾靜脈注射富氫鹽水（10 mL/kg），生理鹽水（10 mL/kg）通過(guò)同樣的方式給予。造模完成后取距回腸末端5 cm處小腸段1 cm，并經(jīng)腹主動(dòng)脈取血3 mL。

1.4 小腸黏膜病理學(xué)形態(tài)變化

小腸段經(jīng)4%多聚甲醛固定12 h后，包埋切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡（×200）下觀察小腸黏膜，并根據(jù)改良Chiu's評(píng)分評(píng)價(jià)損傷程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：正常絨毛和腺體為0分；部分絨毛頂部改變，上皮下Gmenhagen腔開(kāi)始形成為1分；上皮下Gmenhagen腔開(kāi)始形成，腺體輕度損傷為2分；上皮下間隙增大，毛細(xì)血管充血為3分；上皮與固有層中度分離，腺體損傷為4分；部分頂部絨毛脫落為5分；絨毛脫落明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張為6分；固有層絨毛脫落，腺體損傷明顯為7分；固有層開(kāi)始消化、分解為8分；出血、潰瘍?yōu)?分[12]。

1.5 凝血功能檢測(cè)

血液標(biāo)本用1∶9枸櫞酸鈉抗凝管收集，在室溫靜置30 min后離心（3 000 r，10 min），取上清液（血漿）于1.5 mL EP管中，2 h內(nèi)在全自動(dòng)凝血儀上機(jī)檢測(cè)以下凝血功能指標(biāo)：凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、血漿凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白原（FIB）、凝血酶原時(shí)間國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（PT-INR）。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小腸黏膜病理學(xué)形態(tài)變化及Chiu's評(píng)分

與C組相比，R組及R+H組小腸黏膜損傷程度明顯加重，Chiu's評(píng)分明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；R+H組與R組比較，小腸黏膜損傷程度減輕，Chiu's評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；H組與C組相比，Chiu's評(píng)分沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。光鏡下觀察到的各組小腸黏膜如圖1所示。

圖1 各組大鼠小腸黏膜病理變化（HE染色，×200）及Chiu's評(píng)分

2.2 血漿PT、APTT、FIB、TT、PT-INR變化

各組大鼠凝血功能如圖2所示，R組及R+H組PT、APTT、TT時(shí)間均較C組延長(zhǎng)，F(xiàn)IB水平降低，PT-INR值升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與R組相比，R+H組PT、APTT、TT時(shí)間縮短，F(xiàn)IB水平升高，PT-INR值降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；H組和C組相比，以上指標(biāo)無(wú)明顯差異（P ＞ 0.05）。

圖2 各組大鼠凝血功能相關(guān)指標(biāo)比較

3 討 論

正常機(jī)體中，促凝系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)保持動(dòng)態(tài)的生理平衡，一旦這種平衡被打破，凝血功能便會(huì)出現(xiàn)異常，可能形成血栓，亦可出現(xiàn)出血；若凝血功能紊亂持續(xù)不能得到糾正，凝血因子耗竭，血小板大量減少，可能出現(xiàn)失血性休克，也可導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），損害心、肺、肝、腎、腦等多個(gè)器官，出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征（MODS），嚴(yán)重者死亡[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，病理狀態(tài)下凝血功能異常與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，不同炎癥狀態(tài)下，凝血功能異常程度不同[13]。因此，在各種臨床疾病診療過(guò)程中，維持凝血功能正常非常重要。

在臨床工作中，醫(yī)生對(duì)凝血功能的關(guān)注首要有以下幾個(gè)基礎(chǔ)指標(biāo)：凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、血漿凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白原（FIB）、凝血酶原時(shí)間國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（PT-INR）。PT和APTT代表凝血系統(tǒng)功能，分別反映外源性和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)功能，二者時(shí)間延長(zhǎng)提示出血可能，縮短提示高凝狀態(tài)；TT和FIB代表纖溶系統(tǒng)功能，變化方向通常相反，F(xiàn)IB水平升高時(shí)提示高凝，降低提示出血傾向；PT-INR值在臨床上主要用于監(jiān)測(cè)抗凝藥物使用后凝血功能的變化，當(dāng)其值高于4.0時(shí)，提示血液凝固需要很長(zhǎng)時(shí)間，可能引起無(wú)法控制的出血。而INR值低于2.0時(shí)不能提供有效的抗凝，提示抗凝藥物也許需要調(diào)整[14]。INR大于正常值（0.8～1.2），可能出現(xiàn)出血征象，需警惕出血風(fēng)險(xiǎn)。

腸缺血再灌注在臨床上常見(jiàn)，多由于腹主動(dòng)脈瘤、小腸移植等手術(shù)因素或是腸系膜血栓栓塞、失血性或感染性休克、嚴(yán)重?zé)齻燃膊∫蛩卣T發(fā)，炎癥反應(yīng)是其病理生理機(jī)制中關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，腸缺血90 min后再灌注2 h，小腸黏膜絨毛脫落，腺體損傷明顯，固有層充血水腫，表明造模成功。大鼠腸缺血再灌注后，凝血功能的變化表現(xiàn)為PT、APTT、TT的時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)IB水平降低，PT-INR值增大，有出血傾向。

氫氣，自然界中存在的最小氣體分子，具有易得到、無(wú)毒性、價(jià)格低廉的特點(diǎn)。自2007年報(bào)道氫氣具有抗氧化能力以來(lái)，它被應(yīng)用于各種疾病的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及少數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)中，故而發(fā)現(xiàn)其還具有抵抗炎癥、抑制凋亡、細(xì)胞保護(hù)等作用[9,16]。研究發(fā)現(xiàn)，氫氣對(duì)全身各大系統(tǒng)均有保護(hù)作用，如吸入氫氣可以緩解癡呆病情發(fā)展、依賴Akt/GSK3β信號(hào)通路減弱心肌缺血再灌注損傷、改善代謝綜合征、治療肺動(dòng)脈高壓、治療肺吸蟲(chóng)誘導(dǎo)的慢性肝炎、抗癌等[10,17-20]，富氫鹽水是氫氣溶解于生理鹽水中所得，和氫氣具有相同功能。有研究說(shuō)明富氫鹽水經(jīng)腹腔注射，對(duì)腦缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，效果和吸入氫氣相似[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，富氫鹽水干預(yù)大鼠腸缺血再灌注模型后，小腸黏膜損傷減輕，凝血功能指標(biāo)變化減小，凝血功能異常得到一定程度的糾正，減小了出血風(fēng)險(xiǎn)。而富氫鹽水對(duì)凝血功能正常的大鼠，不影響其凝血功能。

4 結(jié)論

在大鼠腸缺血再灌注后，小腸黏膜損傷嚴(yán)重，凝血功能發(fā)生改變，有出血傾向，富氫鹽水可以減輕小腸黏膜病理變化，并改善凝血功能異常狀態(tài)，減小出血風(fēng)險(xiǎn)。但本研究仍存在不足之處，如小腸黏膜損傷程度與凝血功能異常程度相一致，那么兩者之間是否會(huì)存在相關(guān)性，以及富氫鹽水改善腸缺血再灌注后凝血功能異常的具體機(jī)制均有待進(jìn)一步探討。