高通量測序分析臭豆腐中的細菌菌種多樣性

谷靜思 侯 娟 何國慶

（1 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院 浙江省食品微生物技術(shù)重點實驗室 杭州310058 2 哈爾濱工業(yè)大學（深圳）廣東深圳518055 3 德州職業(yè)技術(shù)學院 山東德州253034）

臭豆腐是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，具有悠久的歷史。臭豆腐的制造過程因地區(qū)而不同，以杭州為代表的南方地區(qū)的臭豆腐先要制作臭鹵水[1]。在水中添加蔬菜、肉類或草藥混合，經(jīng)過自然發(fā)酵而成，即利用自然界存在的菌種進行發(fā)酵，也叫作“敞口發(fā)酵”[2-3]。待鹵水成熟后，將豆腐浸泡在其中數(shù)小時至數(shù)天不等，以獲得富含“臭味”的成品。

目前對于臭豆腐中的微生物的多樣性研究，主要還是應用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法。然而，這種分離培養(yǎng)的方法在研究復雜的微生物菌群時，不能很好地反映其中所有微生物的組成，導致低估了菌群數(shù)量和多樣性[4]。高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法相比具有較為明顯的優(yōu)勢，在微生物群落結(jié)構(gòu)的研究方面定量準確、實時檢測等[5-7]。目前，高通量測序技術(shù)廣泛應用于微生物群落結(jié)構(gòu)的探索方面，為探索與發(fā)酵食品相關的微生物種群多樣性提供了巨大的幫助[7-9]。

到目前為止，對于臭豆腐中的微生物資源的研究相對較少，這種傳統(tǒng)小吃中的微生物組成尚不清楚。本研究的目的是將高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法結(jié)合，分析臭豆腐中的乳酸菌的多樣性，了解其微生態(tài)系統(tǒng)，為獲取乳酸菌資源以及規(guī)范臭豆腐的生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自杭州市不同地點的臭豆腐；MRS 培養(yǎng)基、 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；Axygen 細菌基因組DNA 提取試劑盒，杭州愛思進生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設備

YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Powerpac Basic 電泳儀、 ALS-1296 PCR 儀，BioRad 生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；5417R冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；ChamGel 5000凝膠成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌的分離純化 無菌條件下稱取臭豆腐樣品10 g，加入到 90 mL 滅菌后的生理鹽水（0.85%，m/V）中，攪拌至樣品徹底均勻懸浮，取1 mL 懸浮液10 倍梯度稀釋至10-7。取梯度10-5～10-7，從每個梯度吸取100 μL 樣品稀釋液均勻涂布于MRS 和營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基上，分別在30 ℃下培養(yǎng)48～72 h。選取合適的稀釋度（菌落數(shù)在30～300 之間），挑選疑似不同的菌株，經(jīng)3～5 次劃線純化后獲得純菌落。對得到的純培養(yǎng)物進行過氧化氫酶試驗和革蘭氏染色，并鏡檢觀察。將過氧化氫酶陰性，且革蘭氏染色陽性的菌株初步視為乳酸菌；反之，為其他種類細菌。

1.3.2 DNA 提取與PCR 采用試劑盒提取細菌的基因組DNA，并進行PCR 擴增。其中PCR 25 μL 反應體系為：10×buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，正、 反向引物各1.5 μL，ExTaq DNA 聚合酶 （5 U/μL）0.25 μL，DNA 模板2 μL，無菌去離子水16.75 μL。擴增引物為16S rDNA通用引物27F 和1492R。PCR 條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測與DNA 測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。后與NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對。

1.3.4 高通量測序 根據(jù)Axygen DNA 提取試劑盒說明直接從臭豆腐樣品中提取總基因組DNA。通過通用引物 （F：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴增16S rRNA 基因的V3-V5 高變區(qū)，用以下程序以25 μL 體系PCR：98 ℃預變性4 min，98 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，27 個循環(huán)，72℃終延伸7 min。使用454 GS FLX+系統(tǒng)（Roche 454 Life Sciences，USA）基因測序和生物信息學分析均委托派森諾生物科技有限公司完成。比對數(shù)據(jù)庫為SILVA 和NCBI。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法分析乳酸菌多樣性

圖1 基于細菌16S rRNA 測序分析的相對豐度Fig.1 Relative abundance，based on bacterial 16S rRNA sequencing

在NA 與MRS 培養(yǎng)基中，共分離到49 株菌（圖1）。通過16S rRNA 基因測序，最終分離到了11 種乳酸菌，分別是腸球菌 （Enterococcus thailandicus），彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus），乳酸乳球菌 （Lactococcus lactis），肉色明串珠菌（Leuconostoc carnosum），檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum），明串珠菌（Leuconostoc fallax），乳明串珠菌 （Leuconostoc lactis），腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides），巴黎鏈球菌（Streptococcus lutetiensis）和融合魏斯氏菌（Weissella confusa）。此次樣品中，分離到的乳酸菌大部分屬于明串珠菌屬（Leuconostoc）。這與之前的文獻中報道乳桿菌屬 （Lactobacillus）和腸球菌屬（Enterococcus）是臭豆腐中常見的細菌菌群[3，10-11]不同。這很有可能是不同地區(qū)臭豆腐鹵水在原材料的選擇、 制作工藝、 環(huán)境差異等多種因素造成的。

盧義伯等[2]采用定性、定量培養(yǎng)的方法，從臭豆腐的鹵水中分離出的優(yōu)勢菌株熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），在本試驗中也分離得到。此外，本試驗還分離到了Pseudomonas extremaustraliss 和邊緣假單胞菌（Pseudomonas marginalis）兩株假單胞菌。假單胞菌能分解蛋白質(zhì)，是造成食物腐敗的菌種之一，這可能是臭豆腐特殊氣味的形成原因[2，12-13]。文獻中提到的芽孢桿菌（Bacillus）屬[14-16]，此次也分離到了一株地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）。目前雖無報道詳細說明芽孢桿菌與乳酸菌的相互作用及其對臭豆腐風味和營養(yǎng)有影響，但是芽孢桿菌屬的一些菌種可以產(chǎn)生淀粉酶、透明質(zhì)酸和纖維蛋白溶酶，在一些大豆發(fā)酵食品中有重要的作用，對人類健康有益[15，17]。此外，還分離到了一株克氏庫克菌（Kocuria kristinae），這種菌主要來自于自然環(huán)境，是一種極罕見的條件致病菌[18]。

2.2 基于高通量方法分析菌種多樣性

2.2.1 稀釋曲線 稀釋曲線 （Rarefaction curve）是每個樣本中隨機抽取一定量的序列，統(tǒng)計這些序列所代表的OTU 數(shù)目，并以序列數(shù)與OUT 數(shù)來構(gòu)建曲線。它可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否足以反映環(huán)境中的物種多樣性，也可以用來比較不同樣本中的物種多樣性情況。圖2橫坐標為OTU 數(shù)目，縱坐標是樣本序列數(shù)，而樣品的曲線趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)足以覆蓋所有的微生物。對3 個樣品的豐度進行比較可知，樣品中微生物的多樣性豐富程度依次為H1、H3、H2。

2.2.2 豐度分布曲線 豐度分布曲線（Rank abundance curve）通常取物種的序數(shù)為橫坐標，豐度值為縱坐標，它可以反映樣品中物種的分布規(guī)律，即物種豐度和物種均勻度。圖3中橫坐標表示OTU 等級，縱坐標代表OTU 的豐度值。H1 樣品的曲線比其他樣品的曲線稍緩，說明H1 中的微生物分布更均一。

圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves from stinky tofu samples

圖3 樣品豐度分布曲線Fig.3 Rank abundance from stinky tofu samples

2.2.3 Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性是指一個特定地區(qū)或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，而多樣性指數(shù)是反映豐富度和均勻度的綜合指標。主要包括反應群落豐富度的Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)，以及反應群落多樣性的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)（表1）。表1中的Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)顯示H1樣品中群落豐富度最高，其次是H3。另一方面，Shannon 和Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。有表1可以看出H1 和H3 的群落多樣性高于H2。

表1 Alpha 多樣性Table 1 Alpha diversity

2.2.4 PCA 分析 PCA 分析可以直觀的反應數(shù)據(jù)相似性或差異性。如圖4所示，成分1（PC1）和主成分2 （PC2）是造成樣品間的兩個最大差異特征，貢獻率分別為44.45%和14.07%。這個圖中的兩個樣品越接近，它們之間的屬組成就越相似，反之亦然。這表明，H1 和H3 在組成上更相似。而這兩個樣品同H2 呈現(xiàn)明顯的分離狀態(tài)且距離比較遠，可以推斷這兩個樣品與H2 樣品的菌落結(jié)構(gòu)差異比較大。這種現(xiàn)象說明，原料來源不同，微生物的情況差異顯著[19]。

圖4 主成分分析圖Fig.4 PCA analysis from stinky tofu samples

2.2.5 微生物在屬和種的水平進行分類比較 通過高通量測序分析進一步說明樣品的細菌分布情況，結(jié)果分別在圖5A和圖5B以屬和種水平上呈現(xiàn)。如圖5A 所示，樣品具有相對較高的乳酸菌豐度，主要涉及8 個屬，分別是乳桿菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、腸球菌（Enterococcus）、鏈球菌（Streptococcus）、魏斯氏菌（Weissella）、庫特菌（Kurthia）、漫游球菌（Vagococcus）。漫游球菌屬在H2 樣品中豐度值較高，趙國忠等[14]在臭豆腐鹵水樣品也分離到該屬，但在種水平上不同。目前，采用高通量方法研究臭豆腐的菌群構(gòu)成的文獻相對較少。賀靜等[19]通過454 平臺從兩個樣品中分離到了24 個菌屬，其中的優(yōu)勢菌并不是乳酸菌，而分別是厭氧球菌（Anaerococcus）、卟啉單胞菌（Porphyromonas）和氨基桿菌屬（Aminobacterium）。在本試驗中，卟啉單胞菌屬在H1 樣品中占主導地位，比例達到41.19%，其次是乳桿菌屬（37.40%），而乳桿菌屬在H3 中所占比例達到38.99%。而在H2 中擬桿菌門Odoribacter 菌屬居于主導地位，所占比例高達一半。造成這種差異性的原因很大程度上是由于在進行自然發(fā)酵的過程中發(fā)酵環(huán)境的差異性，因此溫度、pH 值以及周圍環(huán)境菌群對臭豆腐發(fā)酵過程的影響，需要進一步的研究。在H1 和H3 中乳酸菌所占比例超過50%，H2 中的乳酸菌含量也達到約三分之一。因此，乳酸菌對臭豆腐菌種的構(gòu)成具有重要作用[3，20-21]。其他屬在某些樣品中具有相對高的豐度，然而，他們在發(fā)酵過程中的作用仍然不清楚，需進一步調(diào)查。

在種水平上的分析（圖5B）顯示，在H1 和H3 樣品中乳桿菌的相對豐度較高，其中沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）相對豐度最高，其次是乳酸乳球菌與嬰兒鏈球菌 （Streptococcus infantarius）。此外，還有一些不可培養(yǎng)的屬于乳桿菌屬細菌也具有較高的相對豐度。乳酸菌在H2 中相對豐度較低，各乳酸菌種的豐度也有所差別。雖然在該樣品中也檢測到沙克乳桿菌，但其相對豐度并不高，河流漫游球菌（Vagococcus fluvialis）是H2樣品中相對豐度值最高的乳酸菌。之前有高通量方法檢測同一地區(qū)的不同臭豆腐鹵水樣品，菌種差異性同樣也很顯著[19]。造成不同樣品間差異的原因，這很有可能與鹵水制備中采用自然發(fā)酵，樣品中的菌落構(gòu)成會受到周圍環(huán)境變化的影響，具有一定的偶然性有關[22]。

圖5 基于細菌16S V3-V5 編碼區(qū)高通量測序分析的相對豐度，臭豆腐樣品的細菌屬（A）和種（B）Fig.5 Relative abundance，based on bacterial 16S V3-V5 tag-encoded high-throughput sequencing analysis，of bacterial genera （A）and species （B）of stinky tofu samples

2.3 兩種方法對比

通過兩種鑒定方法分到離乳酸菌共71 種，其中高通量檢測到的菌種多達66 種，遠多于傳統(tǒng)分離方法得到的菌種。不僅如此，通過高通量方法還發(fā)現(xiàn)了涉及12 個屬20 種不可培養(yǎng)的乳酸菌。沙克乳桿菌、 河流漫游球菌等菌種在高通量測序的臭豆腐中顯示出巨大的豐度，但是卻沒有通過傳統(tǒng)方法檢測到，這很有可能是因為培養(yǎng)基不適合所有乳酸菌，或者在進行培養(yǎng)基培養(yǎng)時，它們在樣品中已經(jīng)死亡。但在傳統(tǒng)培養(yǎng)中分離出的3 種乳酸菌，分別是腸球菌（Enterococcus thailandicus）、肉色明串珠菌和乳明串珠菌，在高通量測序并沒能檢測到?？赡苡蓛蓚€原因造成：首先，這3 個物種可能在臭豆腐樣品中的數(shù)量非常少，因此沒有足夠的DNA 被提取用于高通量測序；第二，高通量測序無法區(qū)分特定的物種與其近親和有限的DNA 長度。目前被報道的文獻中，不同樣品的菌群的構(gòu)成存在差異性，可見敞口發(fā)酵的不穩(wěn)定性使每個臭豆腐都是獨特的。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測序與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，考察了臭豆腐樣品中細菌的多樣性。本試驗采用兩種方法共檢測71 種乳酸菌，臭豆腐中具有豐富的乳酸菌資源，乳酸菌很有可能在臭豆腐發(fā)酵系統(tǒng)中占有優(yōu)勢；高通量測序可以很好地反應出臭豆腐樣品中細菌種類以及各種細菌所占豐度的不同，但仍需從多地區(qū)采集大量樣本，擴大樣本量進行驗證。

在本次研究中，通過高通量測序方法鑒定出212 種菌，比傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法檢測到的菌種更豐富全面，甚至包括一些不可培養(yǎng)的菌種，能夠更加全面地反映菌群的輪廓。高通量測序法在應用中雖受測序深度，閱讀長度以及可用于測序后數(shù)據(jù)分析的算法和數(shù)據(jù)庫的限制[6-7]，但對于深入研究各種生態(tài)系統(tǒng)中微生物組成具有重要意義。

傳統(tǒng)臭豆腐鹵水制作工藝是利用微生物進行自然發(fā)酵，這使得發(fā)酵過程中存在的偶然因素對樣品影響較大，從而導致了同類別的發(fā)酵食品品質(zhì)指標的差異。因此有必要對臭豆腐的原料在發(fā)酵過程中微生物群變化規(guī)律、 風味物質(zhì)和生理生化的變化進行深入的研究，從而能為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)升級提供理論依據(jù)。