射頻加熱對(duì)大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響

郭超凡 張振娜 劉 艷 傅虹飛 陳香維 王云陽(yáng)

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100）

大豆是中國(guó)重要的油料作物，它富含脂肪和蛋白質(zhì)，其中大豆分離蛋白（SPI）因具有良好的功能性質(zhì)、 較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和低廉的價(jià)格而被作為食品原料以及添加劑廣泛使用在食品工業(yè)中[1]。大豆分離蛋白的功能特性主要體現(xiàn)在3 個(gè)方面：（1）水合特性：分散性、溶解性、持水性、增稠性、溶脹性、潤(rùn)濕性及脫水收縮作用等，其中溶解性在飲料工業(yè)及功能食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用；（2）乳化特性：乳化性、發(fā)泡性、持水及持油性，其中冰淇淋等冷凍食品、 湯類(lèi)食品的加工利用其乳化性；（3）流變和質(zhì)構(gòu)特性：凝膠性、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性等，如魚(yú)肉制品工業(yè)和乳酪利用其凝膠性[2]。目前，國(guó)內(nèi)改性大豆分離蛋白產(chǎn)品性能與國(guó)外產(chǎn)品差距明顯，且價(jià)格優(yōu)勢(shì)不明顯，國(guó)外產(chǎn)品仍占據(jù)較大市場(chǎng)，國(guó)產(chǎn)的大豆分離蛋白在食品工業(yè)上僅限于肉制品方面[3]。改善大豆蛋白功能性成為國(guó)內(nèi)食品加工工業(yè)亟待解決的問(wèn)題。

目前，對(duì)于大豆分離蛋白改性的研究主要集中在物理改性、化學(xué)改性、酶法改性和基因工程改性[4-5]。其中，物理改性研究常采用的方法包括：高壓處理、脈沖電場(chǎng)、微波輻照、熱處理、伽馬射線、超臨界流體擠壓和超聲波等[6]。其原理主要是在外力條件下對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的定向變形，一般不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)。Zhou 等[7]使用高強(qiáng)度（20 kHz、80Wcm-2）超聲（HIU）設(shè)備處理大豆球蛋白0～40 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后乳化性和溶解性顯著升高。Wang 等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)高壓（HP）處理（200～600MPa）后大豆分離蛋白的溶解性輕微下降，乳化性顯著升高，然而使乳化穩(wěn)定性下降。蔡建榮等[9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微波功率為1 000 W 時(shí)，在0～40 s，大豆分離蛋白的起泡性、 乳化性和乳化穩(wěn)定性均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并均在40 s 時(shí)達(dá)到最大值。

射頻（Radio frequency，RF）因升溫快速、加熱均勻、 穿透深度大以及低能耗而作為一種新興的電磁加熱技術(shù)，在食品工業(yè)中有巨大的潛力[10]。射頻的電磁波頻率范圍為1～3MHz，能夠引起物料內(nèi)部的極性分子往復(fù)旋轉(zhuǎn)和帶電粒子往復(fù)運(yùn)動(dòng)，從而使物料溫度升高[11-12]。射頻加熱技術(shù)的研究和應(yīng)用主要集中在食品和農(nóng)產(chǎn)品的干燥、殺菌、蒸煮、殺蟲(chóng)及解凍等方面[13]。關(guān)于射頻加熱對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響報(bào)道較少，如：Boreddy 等[14]發(fā)現(xiàn)，射頻輔助熱殺菌能夠提高蛋白粉的凝膠特性；Uemura 等[15]使用射頻閃熱（Radio-frequency flash heating，RF-FH）系統(tǒng)對(duì)豆乳殺菌，對(duì)比傳統(tǒng)加熱，使用RF-FH 殺菌豆乳制成的豆腐具有更高的凝膠強(qiáng)度。關(guān)于射頻加熱對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)使用射頻加熱技術(shù)作為加熱手段，將大豆分離蛋白分散液在不同射頻極板間距（120，160，200 mm）下加熱至預(yù)定的溫度（70，80，90℃）。研究射頻處理前、后大豆分離蛋白的溶解性、乳化性、起泡性和熱穩(wěn)定性，為射頻加熱技術(shù)在大豆制品加工中的應(yīng)用以及大豆蛋白的改性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 大豆分離蛋白（索萊寶，北京）；大豆色拉油（食品級(jí)，市售）；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

1.1.2.1 射頻加熱系統(tǒng) 本試驗(yàn)使用的GF-6A-27-JY 型射頻加熱系統(tǒng)（圖1）由河北華氏紀(jì)元高頻設(shè)備有限公司研制。該設(shè)備由射頻發(fā)生器、加熱室、排氣系統(tǒng)、熱風(fēng)加熱系統(tǒng)和自動(dòng)控制系統(tǒng)等組成，額定功率為6 kW，頻率為27.12 MHz。由上下極板構(gòu)成650 mm×450 mm 的射頻加熱場(chǎng)，其間距可在60～215 mm 間調(diào)節(jié)。樣品內(nèi)部的溫度使用熒光光纖測(cè)溫系統(tǒng)實(shí)時(shí)測(cè)量，檢測(cè)溫度范圍為-30～200 ℃，采集數(shù)據(jù)的頻率最小可達(dá)1s/次。樣品的時(shí)間-溫度曲線通過(guò)軟件輸出。

圖1 射頻加熱系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of RF heating system

1.1.2.2 其它儀器與設(shè)備 HC-3018R 高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；90-4型恒溫磁力攪拌器，上海滬西分析儀器廠；HQFTS-D1F00 熒光光纖測(cè)溫儀，西安和其光電科技有限公司；LGJ-10 冷凍干燥機(jī)，鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；Q-200 熱分析儀，美國(guó)TA 儀器公司；FJ200-S 數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海索映儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白的射頻加熱處理 將一定質(zhì)量的大豆分離蛋白加入至去離子水中，配成0.03 g/mL 的大豆分離蛋白分散液。使用磁力攪拌器在室溫下溫和攪拌至大豆分離蛋白充分溶解。將45 mL 充分溶解的大豆分離蛋白分散液置于50mL 離心管內(nèi)，此時(shí)大豆分離蛋白的液面高度為80 mm。將裝有大豆分離蛋白分散液的離心管置于射頻加熱系統(tǒng)下極板的中心位置，插入測(cè)溫光纖至分散液中心位置。分別在120，160 和200 mm 極板間距下將大豆分離蛋白加熱至預(yù)定溫度（70，80和90 ℃）。待樣品到達(dá)預(yù)定溫度，立即將離心管取出置于冰浴，冷卻至室溫待用。

1.2.2 大豆分離蛋白溶解度的測(cè)定 將射頻加熱前后的大豆分離蛋白分散液在4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心15 min，取出上清液待測(cè)。使用考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定離心前后溶液的蛋白含量[16]，其中：溶解度（%）=上清液蛋白含量/總蛋白含量×100%[17]。

1.2.3 大豆分離蛋白乳化性能的測(cè)定 大豆分離蛋白的乳化性能包括乳化能力和乳化穩(wěn)定性。參照管軍軍等[18]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。

乳化能力（emulsifying capacity，EC），分別將射頻加熱處理前后的大豆分離蛋白分散液稀釋至質(zhì)量濃度為2 mg/mL。取稀釋液24 mL，加入8 mL大豆色拉油，使用高速分散器以20 000 r/min 轉(zhuǎn)速分散1 min，用微量注射器迅速?gòu)牡撞课∪榛?0 μL 加入至5 mL 0.1%的SDS 溶液中，以0.1%SDS 溶液為對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定500 nm 下的吸光值，乳化能力（EC）以公式（1）計(jì)算。

式中：EC——乳化能力（m2/g）；A0——樣品的吸光值；DF——稀釋倍數(shù)（100）；ρ——光程（1 cm）；θ——油體積分?jǐn)?shù)（0.25）。

乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability，ES），將測(cè)定乳化能力后的乳液放置在室溫下10min，按上述方法測(cè)定乳化能力，按公式（2）計(jì)算乳化穩(wěn)定性。

式中：ES——乳化穩(wěn)定性（%）；EC——乳化能力（m2/g）；EC10——10 min 后的乳化能力（m2/g）。

1.2.4 大豆分離蛋白起泡能力的測(cè)定 大豆分離蛋白的起泡性能包括起泡能力和泡沫穩(wěn)定性，參照李迎秋等[19]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。

起泡能力（foam capacity，F(xiàn)C），分別取射頻加熱前后的大豆分離蛋白分散液20 mL 置于離心管內(nèi)，使用高速分散器以20 000 r/min 轉(zhuǎn)速分散1 min，測(cè)其泡沫體積。起泡能力按公式（3）計(jì)算。

式中：FC——起泡能力（%）；V0——分散前的大豆分離蛋白分散液體積（20 mL）；V——分散停止時(shí)泡沫體積（mL）。

泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S），將測(cè)定起泡能力后的泡沫靜置1 h 后，再次測(cè)定泡沫體積。泡沫穩(wěn)定性按公式（4）計(jì)算。

式中：FS——泡沫穩(wěn)定能力 （%）；V30——30 min 后泡沫體積（mL）；V——高速分散停止時(shí)泡沫體積（mL）。

1.2.5 大豆分離蛋白變性溫度的測(cè)定 本試驗(yàn)使用差示掃描量熱法（DSC）測(cè)定大豆分離蛋白的變性溫度。將未處理與射頻處理后的大豆分離蛋白分散液樣品冷凍干燥。分別稱(chēng)取冷凍干燥后的樣品2 mg 加入至鋁制坩堝中，以空白坩堝為對(duì)照，掃描速率為10 ℃/min，掃描溫度范圍為20～180℃，氮?dú)馑俾蕿?0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同極板間距下大豆分離蛋白分散液射頻加熱的時(shí)間-溫度曲線

圖2為在不同極板間距（120，160 和200 mm）下大豆分離蛋白分散液射頻加熱的時(shí)間-溫度曲線圖。由圖2可知，改變極板間距，樣品升至預(yù)定溫度所需的時(shí)間不同。在極板間距為120，160，200 mm 時(shí)加熱至90 ℃所需的時(shí)間分別為121，331 和621 s。極板間距越大，升溫速度越慢，樣品吸收的功率越小。當(dāng)極板間距下降時(shí)，極板間的電容增大，從而使加熱電路的頻率下降[20]。通過(guò)改變極板間距可以調(diào)節(jié)加熱電路的頻率，進(jìn)而使加熱電路的頻率與發(fā)生電路的固有頻率耦合，耦合程度越大，電路中的能量傳遞也就越大。所以，樣品在120～200 mm 極板間距下，隨著極板間距逐漸減小，使得耦合程度越大，樣品吸收的功率增大，樣品升溫速度增大。

2.2 射頻加熱處理對(duì)大豆分離蛋白分散液溶解度的影響

大豆分離蛋白的溶解度是其重要的功能性質(zhì)之一，它與其他功能性如：乳化性、起泡性、疏水性等具有一定相互關(guān)系[21-22]。圖3為射頻處理對(duì)大豆分離蛋白溶解度的影響。由圖3可知，相對(duì)于對(duì)照組射頻加熱處理后的大豆分離蛋白的溶解度均得到顯著（P<0.05）提升，并且隨著溫度升高而增大。當(dāng)終溫度為70 ℃時(shí)，大豆分離蛋白的溶解度隨著極板間距變大而增大；80 ℃時(shí)，在不同極板間距下大豆分離蛋白的溶解度沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的差異；90 ℃時(shí)，大豆分離蛋白在200 mm 極板間距下的溶解度達(dá)到最大值，從未處理的22.48%提高至73.47%，并且明顯高于其他兩個(gè)極板間距。與微波加熱的原理相似，射頻加熱通過(guò)高頻電磁波引起物料內(nèi)部的極性分子往復(fù)旋轉(zhuǎn)和帶電離子往復(fù)運(yùn)動(dòng)來(lái)升高物料溫度[12]。射頻加熱處理時(shí)，高頻電場(chǎng)引起物料內(nèi)部分子發(fā)生摩擦，物料原子間的摩擦引起分子間共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵斷裂[23]，使維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的二硫鍵、 氫鍵以及靜電相互作用等被打破，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，蛋白分子與水的相互作用增強(qiáng)，最終導(dǎo)致溶解度提高。隨著極板間距增大，射頻加熱升溫速率降低，大豆分離蛋白被加熱到所需溫度的處理時(shí)間增長(zhǎng)，導(dǎo)致相同最終溫度下（70 和90 ℃）的溶解度隨極板間距增加而增大。

圖2 不同極板間距下大豆分離蛋白的射頻加熱時(shí)間-溫度曲線Fig.2 Time-temperature curve of SPI dispersion under different electrode gaps by RF heating

2.3 射頻加熱處理對(duì)大豆分離蛋白分散液乳化性能的影響

蛋白質(zhì)的乳化性能是指脂肪乳化的形成和穩(wěn)定，包括乳化能力和乳化穩(wěn)定性。由于大豆分離蛋白具有親水和親油基團(tuán)，因而具有乳化性。蛋白質(zhì)的乳化能力是指在乳狀液從O/W 乳狀液轉(zhuǎn)變成W/O 乳狀液前每克蛋白質(zhì)所能乳化油的體積，乳化穩(wěn)定性是指乳狀液的穩(wěn)定程度。它與疏水性有弱正相關(guān)關(guān)系，還與分子柔性有著重要的關(guān)系。如圖4所示，經(jīng)過(guò)射頻加熱處理后的大豆分離蛋白乳化能力顯著升高，并且隨著溫度升高而增大。當(dāng)射頻加熱處理終溫度分別為70 和80 ℃時(shí)，大豆分離蛋白的乳化能力在3 個(gè)極板間距下均沒(méi)有顯著差異；90 ℃時(shí)，大豆分離蛋白的乳化能力隨著極板間距升高而增大，在200 mm 極板間距時(shí)達(dá)到最大值48.22 m2/g。圖5為射頻加熱對(duì)大豆分離蛋白乳化穩(wěn)定性的影響。由圖可知，經(jīng)過(guò)射頻處理，大豆分離蛋白的乳化穩(wěn)定性輕微提高。當(dāng)處理終溫度為70 ℃和90 ℃時(shí)，大豆分離蛋白的乳化穩(wěn)定性隨著極板間距增大而升高，并且在90 ℃、200 mm 極板間距時(shí)達(dá)到最大值14.78%；80 ℃時(shí)不同極板間距下的大豆分離蛋白沒(méi)有顯著差異。經(jīng)射頻處理后，大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出更多的疏水性氨基酸，使得蛋白表面活性增強(qiáng)、蛋白的柔性提高，從而提高了大豆分離蛋白的乳化能力以及乳化穩(wěn)定性。

圖3 射頻加熱對(duì)大豆分離蛋白分散液溶解度的影響Fig.3 Effect of radio frequency heating on the solubility of SPI dispersion

2.4 射頻加熱處理對(duì)大豆分離蛋白分散液起泡性能的影響

蛋白質(zhì)的起泡性能是指其在氣-液界面形成堅(jiān)韌薄膜使大量氣泡并入和穩(wěn)定的能力，包括起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。起泡能力是指蛋白質(zhì)能產(chǎn)生的界面面積的量，泡沫穩(wěn)定性是指泡沫穩(wěn)定處在重力和機(jī)械力下的能力。具有良好的發(fā)泡性的蛋白質(zhì)必須在起泡過(guò)程中快速被空氣和水界面吸附，然后經(jīng)由分子重排在界面形成具有黏性的薄膜。圖6和圖7分別為射頻處理對(duì)大豆分離蛋白起泡能力以及泡沫穩(wěn)定能力的影響。從圖7可以看出經(jīng)過(guò)射頻處理的大豆分離蛋白的起泡能力顯著升高，并且隨著溫度升高而增加；在終溫度為70 ℃和80 ℃時(shí)，160 mm 和200 mm 極板間距下大豆分離蛋白的起泡能力顯著高于120 mm；90 ℃時(shí)，大豆分離蛋白的起泡能力隨著極板間距增大而升高，并且在200 mm 極板間距下達(dá)到最高值109.71%。圖8可以看出，經(jīng)射頻處理后大豆分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性顯著降低。在極板間距為160 mm 和200 mm 時(shí)泡沫穩(wěn)定性之間差異較?。?20 mm 時(shí)，隨著溫度先降低，后升高，在80 ℃達(dá)到最小值32.30%。隨著射頻處理使大豆分離蛋白分子產(chǎn)生極化現(xiàn)象，分子部分展開(kāi)，內(nèi)部的疏水殘基暴露在蛋白質(zhì)表面，促進(jìn)水-空氣界面生成，所以大豆分離蛋白的起泡能力升高[9]。而隨著內(nèi)部疏水殘基的暴露，極化的蛋白分子之間通過(guò)非共價(jià)鍵重新形成更大的分子聚集體，水-空氣界面膜的穩(wěn)定性下降，泡沫穩(wěn)定性下降。

圖4 射頻加熱對(duì)大豆分離蛋白分散液乳化能力的影響Fig.4 Effect of radio frequency heating on the emulsifying capacity of SPI dispersion

圖5 射頻加熱對(duì)大豆分離蛋白分散液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of radio frequency heating on the emulsifying stability of SPI dispersion

圖6 射頻加熱對(duì)大豆分離蛋白分散液起泡能力的影響Fig.6 Effect of radio frequency heating on the foam capacity of SPI dispersion

2.5 射頻處理對(duì)大豆分離蛋白熱穩(wěn)定性的影響

因具有較強(qiáng)的分辨能力、靈敏度高、用料少等優(yōu)點(diǎn)，差示掃描量熱法（DSC）被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)熱變性研究中，是一種研究熱性質(zhì)的有效手段，能夠提供熱穩(wěn)定性及熱變性的有效信息[24]。在DSC 譜圖中，最大峰對(duì)應(yīng)的溫度通常被用來(lái)確定變性的溫度，并且變性溫度也代表了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

圖7 射頻加熱對(duì)大豆分離蛋白分散液泡沫穩(wěn)定能力的影響Fig.7 Effect of radio frequency heating on the foaming stability of SPI dispersion

由圖9可以看出，經(jīng)射頻處理后，大豆分離蛋白的變性溫度相較于未處理的大豆分離蛋白樣品均升高；當(dāng)極板間距為120 mm 時(shí)，大豆分離蛋白的變性溫度在射頻處理終溫度為70 ℃時(shí)顯著升高，后隨著溫度升高而逐漸降低，90 ℃時(shí)與未處理的大豆分離蛋白變性溫度接近；當(dāng)極板間距為160 以及200 mm 時(shí)，大豆分離蛋白的變性溫度在70 ℃沒(méi)有明顯變化，但隨著溫度升高，在80 以及90 ℃時(shí)明顯增大。很多食品在加工中需要熱處理，蛋白質(zhì)的功能性可能會(huì)因?yàn)闊峋奂鴮?dǎo)致不溶，難以發(fā)揮作用。射頻處理可以使大豆分離蛋白的變性溫度升高，說(shuō)明射頻處理可以提高大豆分離蛋白的熱穩(wěn)定性。

圖8 不同射頻處理?xiàng)l件加熱大豆分離蛋白分散液的DSC 圖譜Fig.8 DSC thermograms of SPI with different conditions of radio frequency heating

3 結(jié)論

1）射頻加熱對(duì)大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響：射頻加熱可以提高大豆分離蛋白的溶解性、乳化性、起泡能力以及熱穩(wěn)定性。原因是射頻加熱誘導(dǎo)了大豆分離蛋白分子極化，破壞了維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的疏水相互作用力，使蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，蛋白分子結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)，分子柔性增加，因此溶解性、 乳化性、 起泡能力以及熱穩(wěn)定性增加。隨著射頻極板間距增大，溶解性、乳化性、起泡能力以及熱穩(wěn)定性逐漸增加，并在200 mm 時(shí)達(dá)到最高值。但是，經(jīng)射頻處理的大豆分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性降低，相較于120 mm 極板間距，160 和200 mm 極板間距時(shí)泡沫穩(wěn)定性降低較少。

2）射頻加熱處理能夠影響大豆分離蛋白的功能特性，而功能和結(jié)構(gòu)之間存在一定的相互聯(lián)系，因此，射頻加熱處理對(duì)大豆分離蛋白的空間結(jié)構(gòu)也具有一定的影響。關(guān)于射頻加熱處理對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的影響程度和機(jī)理今后還需進(jìn)一步的探討。