食品微生物實(shí)驗(yàn)室菌種的管理

蘇嘉妮 周 露

（廣東省食品檢驗(yàn)所 廣東廣州 510435）

1 前言

食品安全關(guān)乎民生大事，我國(guó)每年都會(huì)發(fā)生食物中毒事件，大部分是微生物污染引起的。食品微生物檢驗(yàn)作為食品安全監(jiān)測(cè)的重要手段，可以有效減少食源性疾病的發(fā)生[1]。CNAS-CL01-A001 2018《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室必須保存滿足試驗(yàn)需要的菌種用于檢驗(yàn)方法需要的陰陽(yáng)性對(duì)照、培養(yǎng)基質(zhì)量驗(yàn)收、方法確認(rèn)、人員培訓(xùn)考核和結(jié)果質(zhì)量保證[2]，因此，菌種的保存管理，對(duì)保證微生物實(shí)驗(yàn)過(guò)程的質(zhì)量控制的有效性起到至關(guān)重要的作用。菌種保存是微生物檢驗(yàn)工作中的常規(guī)技術(shù)，科學(xué)保存和管理關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 菌種的來(lái)源

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌種

至少定義到屬或種水平的菌種，按菌種特性進(jìn)行分類(lèi)和描述，官方菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得，最好來(lái)源于食品或水[3]。相關(guān)機(jī)構(gòu)包括美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）、中國(guó)普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）、工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心（CMCC）等。

2.2 野生菌種

由日常檢驗(yàn)樣品或能力驗(yàn)證、盲樣考核獲得的可疑菌種，通過(guò)分離純化，生理生化試驗(yàn)鑒定得到的野生菌種，或者通過(guò)其他途徑（與他人交換、贈(zèng)送）獲得的非標(biāo)準(zhǔn)菌種，提供者需要提供菌種的鑒定材料，由實(shí)驗(yàn)室菌種管理人員登記入庫(kù)。

3 菌種的管理

菌種的管理是實(shí)驗(yàn)室一項(xiàng)重要的工作，實(shí)驗(yàn)室用于實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制和操作評(píng)估，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。規(guī)范化的管理菌種，要求菌種的購(gòu)買(mǎi)、驗(yàn)收、復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代、保存、使用、銷(xiāo)毀有文件化的程序管理，進(jìn)一步加強(qiáng)生物安全的管理，保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員和公眾健康[4，5]。本實(shí)驗(yàn)室從人、機(jī)、料、法、環(huán)這幾方面進(jìn)行菌種的全面質(zhì)量控制并形成記錄，確保其溯源性和穩(wěn)定性。

3.1 人員

菌種需要專(zhuān)人管理，管理人員負(fù)責(zé)菌種的申購(gòu)、驗(yàn)收、復(fù)蘇、驗(yàn)證、傳代、保管。管理人員必須要有認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度，熟悉微生物檢驗(yàn)操作，充分了解菌種的基礎(chǔ)知識(shí)，經(jīng)常積累工作經(jīng)驗(yàn)，清楚知道各種菌種復(fù)蘇傳代保存所需最合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。購(gòu)買(mǎi)菌種要選擇有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)，菌種管理人員驗(yàn)收菌種時(shí)，要檢查每一支菌種是否有質(zhì)量證明或檢驗(yàn)報(bào)告單，不僅要進(jìn)行外觀檢查，還需進(jìn)行純度和特性的確認(rèn)，確保菌種的活性。菌種管理人員從菌種接收當(dāng)日，所有的活動(dòng)都要形成記錄并且詳細(xì)登記，對(duì)每一支保存的菌種都有唯一性標(biāo)識(shí)，包括菌種名稱、菌種號(hào)、代數(shù)、日期，保證所有購(gòu)入的菌種都有完整的身份可以追溯。

3.2 儀器設(shè)備

菌種的保存需要實(shí)驗(yàn)室配備相應(yīng)的設(shè)備，包括低溫冰箱、超低溫冰箱、液氮罐、冷凍干燥機(jī)等，并實(shí)行“雙人雙鎖”管理，對(duì)所有設(shè)備應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控并定期檢查和保養(yǎng)，需要溫度監(jiān)控的設(shè)備應(yīng)形成記錄，發(fā)現(xiàn)不正常及時(shí)維修。

3.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)的養(yǎng)料，不同菌種應(yīng)根據(jù)其生物學(xué)特性選擇合適的培養(yǎng)基，以利于菌種的生長(zhǎng)，以下介紹食品微生物實(shí)驗(yàn)室常用菌種的復(fù)蘇、傳代所用合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，詳見(jiàn)表1。

表1 菌種培養(yǎng)方法

3.4 菌種保存的方法

微生物具有容易發(fā)生變異的特性，因此，在保存菌種的過(guò)程中，應(yīng)挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)的基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境，或相對(duì)靜止使微生物的代謝處于最不活躍的狀態(tài),才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其保持菌種原有的優(yōu)良特性，低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境可抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖[6]。菌種保存時(shí)，最好采用2種以上方法或盡可能存放在2 個(gè)以上的保藏設(shè)備，可避免因保存不當(dāng)導(dǎo)致菌種死亡或菌種意外流失的情況發(fā)生。對(duì)于基層食品微生物實(shí)驗(yàn)室常使用以下方法對(duì)菌種進(jìn)行保存[7]。

3.4.1 傳代保存法

此法適用于保存工作菌種。根據(jù)菌種的特性選擇適合于生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，純化菌種轉(zhuǎn)接于適宜的平板或瓊脂斜面培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基，經(jīng)適當(dāng)?shù)臏囟群蜁r(shí)間培養(yǎng)后，用封口膜將管塞部分包扎好置于4℃左右冰箱保存，特別注意銅綠假單胞菌、副溶血性弧菌、非O1/O139 群霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌等需置于室溫保存。傳代保存時(shí)間因微生物種類(lèi)不同而異，一般為一周至2～3 個(gè)月不等，該方法只適用于短期需要用的菌種保存。此法雖簡(jiǎn)單方便，但菌種多次傳代易使菌種發(fā)生變異，微生物特性改變，因此，GB/T 27405—2008 《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品微生物檢測(cè)》規(guī)定，工作菌種傳代次數(shù)不超過(guò)5 代[8]。

3.4.2 液體石蠟保存法

液體石蠟要在121℃，30 min 高壓滅菌，滅菌后放在烘箱中，160℃左右干燥1～2 h 或40℃恒溫箱中干燥3 h，蒸發(fā)水分直至澄清透明。在傳代培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)后注入無(wú)菌液體石蠟，石蠟高度超過(guò)1 cm，使其覆蓋整個(gè)斜面或半固體，達(dá)到菌體與空氣隔絕，防止水分蒸發(fā)，減緩菌種代謝活動(dòng)。將試管直立放在4℃左右冰箱保存，保存時(shí)間1年左右。保存期間要定期檢查，發(fā)現(xiàn)液體石蠟露出菌體斜面時(shí)，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充滅菌液體石蠟。

3.4.3 甘油保存法

此法適用于保存標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種。甘油是一種低溫保護(hù)劑，低溫有利于降低微生物的活性，甘油能滲透到細(xì)胞內(nèi)，避免水結(jié)冰產(chǎn)生冰晶損傷細(xì)胞。將待保菌種通過(guò)肉湯增菌培養(yǎng)后，可用甘油原液保存，也可以用甘油—生理鹽水保存液保存，甘油含量為20%～30%[9]，保存溫度為-80～-60℃或-20℃左右，保存時(shí)間1～3年不等。

3.4.4 瓷珠保存法

此法較甘油保存法，時(shí)間更長(zhǎng)久。將菌種接種至適宜的平板培養(yǎng)基，經(jīng)適當(dāng)溫度時(shí)間培養(yǎng)后，直接刮取平皿上生長(zhǎng)活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物置于瓷珠保藏管，濃度達(dá)到3～4 麥?zhǔn)蠞岫?，?lái)回顛倒搖勻使細(xì)菌或孢子有效地吸附在瓷珠表面（切勿渦旋震蕩），盡可能將與菌種混勻后的保護(hù)液吸凈，避免液體反復(fù)凍融形成冰晶對(duì)菌種造成損傷，加速?gòu)?fù)蘇的過(guò)程。保存溫度為-80～-60℃，保存時(shí)間3～10年不等。

3.5 菌種保存環(huán)境及生物安全

如何保證菌種長(zhǎng)期有效的保存，環(huán)境的控制至關(guān)重要。低溫環(huán)境可降低微生物的生長(zhǎng)速度，因此，實(shí)驗(yàn)用工作菌種常存放在2～8℃，儲(chǔ)備菌種存放在-20℃和-80℃。微生物菌種的保藏工作不能對(duì)周?chē)h(huán)境造成污染和危害，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要無(wú)菌操作，做好個(gè)人防護(hù)，避免污染。對(duì)變異、污染、過(guò)期、使用后的菌種要及時(shí)銷(xiāo)毀，滅菌條件為121℃，30 min，并做好相關(guān)記錄。

菌種的管理應(yīng)嚴(yán)格按照 《病原微生物生物安全通用要求》《人間傳染的病原微生物名錄》《動(dòng)物病原微生物分類(lèi)名錄》及SN/T 2632—2010《微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程》的要求執(zhí)行[10]。原則上，菌種不得外借，如果要帶離實(shí)驗(yàn)室需上級(jí)批準(zhǔn)，詳細(xì)記錄，確保安全。

3.6 菌種相關(guān)記錄

記錄是保證菌種溯源性的重要文件，因此，菌種的所有記錄必須詳細(xì)登記并存檔，以下介紹標(biāo)準(zhǔn)菌種的驗(yàn)收、復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代、使用、銷(xiāo)毀一切活動(dòng)所需形成的記錄供參考[11]。

3.6.1 菌種的驗(yàn)收

實(shí)驗(yàn)室在接收菌種時(shí)，應(yīng)檢查其外觀的完整性，并索取標(biāo)準(zhǔn)菌種質(zhì)量證明材料或檢驗(yàn)報(bào)告單，相關(guān)證明需加蓋資質(zhì)機(jī)構(gòu)的公章，并填寫(xiě)接收記錄，內(nèi)容包括：菌種基礎(chǔ)信息（菌種名稱、編號(hào)、代數(shù)、數(shù)量、基質(zhì)類(lèi)型）和菌種來(lái)源信息（菌種來(lái)源、購(gòu)入時(shí)間、有效期）。

3.6.2 菌種的復(fù)蘇

復(fù)蘇是使用保藏菌種的第一步，活化菌種使其恢復(fù)旺盛的生命活力，按照菌種說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行復(fù)蘇。

3.6.3 菌種的確認(rèn)

菌種活化后，需要進(jìn)行菌種純度和特性的確認(rèn)，并填寫(xiě)確認(rèn)記錄，內(nèi)容包括菌種名稱、編號(hào)、驗(yàn)證依據(jù)、革蘭氏染色、分離培養(yǎng)形態(tài)鑒定、生化試驗(yàn)、鑒定人員、結(jié)果判定。對(duì)鑒定結(jié)果符合的菌種才可以進(jìn)行保存和傳代。

3.6.4 菌種的傳代

從具有資質(zhì)認(rèn)定資格的機(jī)構(gòu)購(gòu)買(mǎi)的質(zhì)控菌種為0 代，菌種通過(guò)介質(zhì)培養(yǎng)增加1 代，傳代不超過(guò)5 代，填寫(xiě)傳代記錄表，內(nèi)容包括：菌種名稱、母代編號(hào)、代數(shù)、制成代編號(hào)、保種基質(zhì)、數(shù)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、存放溫度、保存時(shí)間、操作者。

3.6.5 菌種使用和銷(xiāo)毀

菌種使用需經(jīng)管理人同意，并填寫(xiě)領(lǐng)用記錄，內(nèi)容包括：菌種名稱及編號(hào)、使用日期、用途、使用人和管理人簽字確認(rèn)。菌種銷(xiāo)毀應(yīng)嚴(yán)格遵守生物安全制度，填寫(xiě)銷(xiāo)毀記錄及滅菌記錄。

4 結(jié)語(yǔ)

菌種作為重要的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定符合實(shí)驗(yàn)室自身情況的菌種管理工作細(xì)則，并嚴(yán)格執(zhí)行。菌種應(yīng)從認(rèn)可機(jī)構(gòu)購(gòu)買(mǎi)并附有證書(shū)。菌種保存需從人、機(jī)、料、法及環(huán)5 方面進(jìn)行控制，并保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作規(guī)范，避免菌種污染，同時(shí)注意生物安全，做好個(gè)人防護(hù)。實(shí)驗(yàn)室菌種的管理需要制定文件化的程序，從申購(gòu)、保管、領(lǐng)用、使用、傳代等方面規(guī)范化，確保溯源性和穩(wěn)定性，才能保證菌種資源長(zhǎng)期有效的保藏，以便用于日常使用及交流、研究。