烏頭屬植物ITS 條形碼的序列及結(jié)構(gòu)特征研究

覃 瑞，張丹丹，劉 虹，吳智華，張婧捷，韓 迪，王 靖

(1.中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074；2 農(nóng)業(yè)部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所，北京 100081)

毛茛科( Ranunculaceae)烏頭屬(Aconitum L.)在我國記載分布200 多種[1]，分為露蕊烏頭亞屬(Subgen. Gymnaconitum )、烏頭亞屬(Subgen. Aconitum)、牛扁亞屬(Subgen. Paraconitum)，3 個亞屬中約170種植物主要分布于青藏高原及其臨近地區(qū)；除海南島外，其他各省區(qū)亦均有分布[2-3].烏頭屬植物含有烏頭堿等生物堿，在民族地區(qū)廣泛用于治療跌打損傷、風(fēng)濕骨痛以及流感等[4]. 在《本草綱目》、《中華草本》、《傷寒論》中烏頭類藥物及其使用方法均有記載[5].中國藥典1977 版收錄了雪上一枝蒿(短柄烏頭的塊根、葉、花蕾、花、幼苗)，中國藥典2015 版收載了草烏(北烏頭的干燥塊根)，川烏(烏頭的干燥母根)，附子(烏頭的干燥子根)[6]. 目前報道的藥用成分主要是其中含有的二萜生物堿，具有鎮(zhèn)痛、消炎、局麻等效果.近年來從高烏頭根中提取的拉巴烏頭堿(lappaconine)制成的氫溴酸鹽[7]，由于其良好的鎮(zhèn)痛不成癮等特性使高烏頭藥材具有廣泛的應(yīng)用前景.然而由于烏頭屬植物形態(tài)上具有高度相似性，在使用中同名異物或同物異名的現(xiàn)象普遍存在[8]，比如紫烏頭在我國民間就常做草烏入藥，伏毛鐵棒錘的塊根在藏族有作“雪上一枝蒿”藥用[9]. 僅從形態(tài)學(xué)上鑒定烏頭屬植物容易導(dǎo)致藥材的混用[10-11]，因此根據(jù)分子特征來鑒定烏頭屬植物更為準(zhǔn)確，可為道地藥材的使用與推廣提供分子學(xué)鑒定依據(jù).

DNA 條形碼是利用若干DNA 片段作為標(biāo)準(zhǔn)片段，對物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確的自動化標(biāo)記，將DNA 序列與生物物種相對應(yīng)[12].2009 年國際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組建議將rbcL ＋ matK 組合作為陸地植物的核心DNA 條形碼[13]；2011 年中國條形碼研究團(tuán)隊(duì)建議將ITS(Internal Transcribed Space) 或ITS2(Internal Transcribed Space 2)作為陸地植物核心條形碼的補(bǔ)充條形碼[14].ITS 是指18S rDNA 和28S rDNA 基因的間隔序列，由ITS1 區(qū)、5.8S 區(qū)、ITS2 區(qū)組成，這段序列進(jìn)化速度較快，且近緣種的進(jìn)化速度比較一致，不僅廣泛用于近緣屬、種間、屬內(nèi)的分子系統(tǒng)學(xué)及鑒別，而且也廣泛用于種內(nèi)居群間的差異性研究[15].采用ITS 序列來分析不同烏頭屬植物，為烏頭屬道地藥材分類和使用提供分子學(xué)證據(jù)，為后續(xù)青藏地區(qū)相關(guān)研究提供基礎(chǔ).

另外根據(jù)ITS 的二級結(jié)構(gòu)與補(bǔ)償性堿基配對變化(CBCs，compensatory base pair changes)位點(diǎn)來探究烏頭屬種間雜交情況.目前在與ITS 二級結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究中，CBCs 開始越來越多的應(yīng)用到種間和種內(nèi)關(guān)系的研究中[16].Muller 等人用大量的數(shù)據(jù)對CBC criterion 假設(shè)進(jìn)行了驗(yàn)證，對30 萬個ITS2 二級結(jié)構(gòu)綜合分析表明，兩個個體之間存在CBC，它們是兩個不同的種的概率約為93%；兩個個體之間不存在CBC，它們是同一種的概率約為76%[17].因此，以此來分析不同烏頭屬植物之間的親緣關(guān)系與遺傳距離，對青藏地區(qū)種質(zhì)資源的研究具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究材料以甘肅遵義地區(qū)烏頭屬植物為主，在湖北、陜西、四川、河南、甘肅采集形態(tài)相似的烏頭屬植物，并與新疆地區(qū)形態(tài)相似的烏頭屬植物相比較.收集9 種烏頭屬材料，共11 個樣本.經(jīng)實(shí)驗(yàn)室專家依形態(tài)學(xué)鑒定，ZY(遵義)烏頭為高烏頭或白喉烏頭或花葶烏頭，在當(dāng)?shù)赜址Q貴州穿心蓮、麻布袋、毛茛等，神農(nóng)架、太白山、青城山、宣恩、利川、老界嶺的為高烏頭，甘肅白水江為贛皖烏頭，新疆為空莖烏頭. 另外，從GenBank 下載了已測序的國內(nèi)烏頭屬植物共75 條序列.詳細(xì)材料信息見表1.

1.2 材料與方法

1.2.1 DNA 提取9 種烏頭屬植物采集于不同產(chǎn)地，對其硅膠干燥的葉片，采用改良的CTAB 法提取總DNA.

1.2.2 擴(kuò)增與測序

使用引物ITS5、ITS4[17]，擴(kuò)增全長ITS(包括5.8S) 區(qū) 域. 引 物 序 列: ITS4: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3； ITS5: 5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 .PCR 擴(kuò)增程序:70 ℃4 min；94 ℃1 min，52 ℃20 s，72 ℃50 s；94 ℃20 s，52 ℃20 s，72 ℃50 s(36 cycle)；72 ℃4 min；4 ℃∞.PCR 反應(yīng)體系為50 μl:ITS4 與ITS5 各2.5 μl(10 μm/L)，擴(kuò)增Mix 25 μl，DNA 2.5 μl(10 ng/μl)，H2O 17. 5 μl.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，試劑盒切膠回收，送至武漢擎科偉業(yè)生物科技有限公司進(jìn)行ABI3730 測序.

2 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得 DNA 序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTN 比對，依相似性最高得分排序，與烏頭屬植物相似分值達(dá)到99 以上，從GenBank 下載國內(nèi)烏頭屬植物的序列.將實(shí)驗(yàn)所得序列與GenBank 下載序列一起在MEGA X 進(jìn)行比對(Alignment)，去除兩端的序列，得到可分析的ITS 總長，基于K2P(Kimura 2-parameter)模型計(jì)算9 種烏頭屬植物的遺傳距離，用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建距離樹，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性用1000 次重復(fù)的自展檢驗(yàn)(Bootstrap analysis)來評估，分支支持率低于50% 的合并. 從GenBank 下載ITS1 與ITS2 序列，利用MEGA X 將下載的ITS1 和ITS2 序列與實(shí)驗(yàn)所得ITS 序列比對，得到可分析的ITS1 和ITS2 序列，運(yùn)用Freiburg RNA Tools[18]預(yù)測ITS1 以及ITS2 一致二級結(jié)構(gòu)，ITS1 序列利用mfold web serve[19]預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)的37℃(http:/ /unafold.rna. albany. edu/)；ITS2 序列在ITS2 Database (http: / /its2. Bioapps. Biozentrum. uniwuerzburg.de/)上預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，將DNA 序列與二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)入4SALE[20-21]統(tǒng)計(jì)軟件中，比對ITS2 二級結(jié)構(gòu)和序列，統(tǒng)計(jì)CBCs[22]位點(diǎn).

表1 材料來源Table 1 Material source

Aconitum monanthum 高山烏頭 AY189803 Aconitum stapfianum 玉龍烏頭 AY189786 Aconitum episcopale 紫烏頭 AY189794 Aconitum campylorrhynchum 彎喙烏頭 AY189797 Aconitum sungpanense 松潘烏頭 AY189796 Aconitum vilmorinianum 黃草烏 AY189787 Aconitum cannabifolium 大麻葉烏頭 AY189801 Aconitum hemsleyanum 瓜葉烏頭 AY189793 Aconitum volubile 蔓烏頭 AY189802 Aconitum tsaii 碧江烏頭 AY189784 Aconitum henryi 川鄂烏頭 KF022318 Aconitum bulbilliferum 珠芽烏頭 AY571360 Aconitum carmichaelii var. hwangshanicum voucher 黃山烏頭 KY417273 Aconitum kusnezoffii 北烏頭 KY417295 Aconitum sczukinii 寬葉蔓烏頭 KX369369 Aconitum brachypodum 短柄烏頭 烏頭組Sect. Aconitum AY189789 Aconitum ludlowii 江孜烏頭 短柄烏頭系Ser. KM079165 Aconitum flavum 伏毛鐵棒錘 Brachypoda AY571357 Aconitum pendulum 鐵棒錘 KY417311 Aconitum anthoroideum 擬黃花烏頭 KY417263 Aconitum coreanum 黃花烏頭 KY417276 Aconitum sessiliflorum 縮梗烏頭 AY164648 Aconitum piepunense 中甸烏頭 烏頭組Sect. Aconitum AY189800 Aconitum delavayi 馬耳山烏頭 興安烏頭系Ser. Ambigua AY189785 Aconitum kongboense 工布烏頭 KM079168 Aconitum richardsonianum 直序?yàn)躅^ KM098011 Aconitum liangshanicum 涼山烏頭 AY571364 Aconitum legendrei 冕寧烏頭 AY571354 Aconitum refractum 狹裂烏頭 KY417321 Aconitum liljestrandii 貢嘎烏頭 KY417300 Aconitum tongolense 新都橋?yàn)躅^ AY571350 Aconitum refractum 狹裂烏頭 AY571349 Aconitum ouvrardianum 德欽烏頭 KY417310 Aconitum chienningense 乾寧烏頭 AY164646 Aconitum falciforme 鐮形烏頭 KY417281 Aconitum contortum 蒼山烏頭 烏頭組Sect. Aconitum AY189788 Aconitum forrestii 麗江烏頭 顯柱烏頭系Ser. Stylosa AY189783 Aconitum transsectum 直緣烏頭 AY189791 Aconitum georgei 長喙烏頭 AY189792 Aconitum bulleyanum 滇西烏頭 AY189798 Aconitum rockii 擬康定烏頭 KF022320 Aconitum tatsienense 康定烏頭 AY571348 Aconitum franchetii 大渡烏頭 KY417288 Aconitum nagarum 保山烏頭 烏頭組Sect. Aconitum AY189790 Aconitum huiliense 會理烏頭 保山烏頭系Ser. Bullatifoli AY571362 Aconitum naviculare 船盔烏頭 烏頭組Sect. Aconitum KM097993 Aconitum pulchellum 美麗烏頭 圓葉烏頭系Ser. KM079162

Aconitum hamatipetalum 鉤瓣烏頭 Rotundifolia Steinb. AY571355 Aconitum tanguticum 甘青烏頭 烏頭組Sect. Aconitum KM098030 Aconitum spiripetalum 螺瓣烏頭 甘青烏頭系Ser. Tangutica AY571345 Aconitum nemorum 林地烏頭 烏頭組Sect. Aconitum. AY571361 Aconitum karakolicum 多根烏頭 準(zhǔn)噶爾烏頭系Ser. AY571358 Aconitum soongaricum 準(zhǔn)噶爾烏頭 Grandituberosa KX369361 Aconitum polycarpum 多果烏頭 烏頭組Sect. Aconitum.多果烏頭組Sect. AY571356 Aconitum brunneum 褐紫烏頭 Sinaconitum AY571344烏頭組Sect. Aconitum褐紫烏頭系Ser. Brunnea Aconitum racemulosum 巖烏頭 烏頭組Sect. Aconitum KY417317巖烏頭系Ser.Racemulosa Aconitum gymnandrum 露蕊烏頭 露蕊烏頭亞屬 AY150238 Subgen. Gymnaconitum

3 結(jié)果

3.1 種內(nèi)種間遺傳變異分析

實(shí)驗(yàn)所得rDNA 序列與從GenBank 下載序列，以露蕊烏頭(Aconitum gymnandrum) 為外類群，利用MEGA X 進(jìn)行比對，得到可分析的ITS1(表2)長度在244 ～250bp，平均GC 含量60.5%，檢測到保守位點(diǎn)(conserved sites)158 個、變異位點(diǎn)(variable sites)89個、簡約信息位點(diǎn)(parsimony-informative sites)31 個.ITS2 可分析全長217 ～220bp，平均GC 含量61.2%，檢測到保守位點(diǎn)(conserved sites)167 個、變異位點(diǎn)(variable sites)53 個、簡約信息位點(diǎn)(parsimony-informative sites)20 個.10 個種ITS1 的K2P(Kimura 2-parameter)遺傳距離表(表3)顯示分布于0 至0.331之間，平均遺傳距離為0.110.其中XE(宣恩)與LC01(利川)遺傳距離為0，露蕊烏頭與其余幾種遺傳距離均大于0.2，其次是ZY 與各種的遺傳距離偏大，表現(xiàn)出明顯的差異，露蕊烏頭為露蕊烏頭亞屬，ZY 為烏頭亞屬，其余均為牛扁亞屬且遺傳距離偏小.ITS2 遺傳距離表(表4)顯示種間與種內(nèi)水平上，ITS2 的遺傳距離小于ITS1，在這幾種烏頭屬植物中，ITS1 的變異程度大于ITS2.

表2 ITS 的長度及GC 含量統(tǒng)計(jì)Table 2 ITS length and GC content statistics

表3 烏頭屬植物ITS1 的遺傳距離Table 3 Genetic distance of ITS1

表4 烏頭屬植物ITS2 的遺傳距離Table 4 Genetic distance of ITS2

3.2 ITS 一級結(jié)構(gòu)聚類分析

將實(shí)驗(yàn)所得序列與GenBank 下載序列一起在MEGA X 進(jìn)行比對(Alignment)，去除兩端的序列，基于K2P(Kimura 2-parameter)用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建距離樹(圖1). 結(jié)果顯示，在與GenBank 序列聚類的鄰接樹中，以露蕊烏頭(A. gymnandrum)為外類群，在下屬分支中，牛扁亞屬與烏頭亞屬能完全區(qū)分開，ZY 與其他8 種烏頭屬植物屬于不同亞屬，為烏頭亞屬植物，其他8 種為牛扁亞屬植物.ZY(遵義)與北烏頭(A. kusnezoffii)聚為一支，XJ(新疆)與空莖烏頭(A. apetalum)bootstrap value 為99，花葶烏頭(A.scaposum)與LC01(利川)、LC02(利川)、QCHS(青城后山)、XE(宣恩)、SNJ(神農(nóng)架)的bootstrap value 為80，TBS(太白山)、LJL02(利川)與高烏頭(A. sinomontanum)聚為一支，BSJ(白水江)烏頭與贛皖烏頭(A. finetianum)的bootstrap value 為83. 亞屬水平上的發(fā)育樹分類與形態(tài)學(xué)分類一致，XJ(新疆)、BSJ(白水江)、TBS(太白山)與LJL(老界嶺)種水平的聚類與形態(tài)學(xué)一致.

圖1 基于ITS 序列構(gòu)建鄰接樹，Bootstrap ＝1000Fig.1 Building neighbor adjacency tree based on ITS sequence， Bootstrap ＝1000

將9 種烏頭聚類，觀察9 種烏頭的親緣關(guān)系. 基于ITS K2P(Kimura 2-parameter)模型構(gòu)建的鄰接樹(圖2)顯示ZY(遵義)烏頭為外類群，BSJ(白水江)、TBS(太白山)、LJL01(老界嶺)與LJL02(老界嶺)聚為一支，具有較近的親緣關(guān)系；XJ(新疆)烏頭與QCHS(青城后山)、LC01(利川)、XE(宣恩)、LC02(利川)、SNJ(神農(nóng)架)位于二級分支，bootstrap value 為59，LC01(利川)與XE(宣恩)的距離最近.驗(yàn)證了ZY(遵義)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，其次是XJ(新疆)，BSJ(白水江)、TBS(太白山)、LJL(老界嶺)為一類，SNJ(神農(nóng)架)、QCHS(青城后山)、LC(利川)和XE(宣恩)為一類.

圖2 9 種不同產(chǎn)地烏頭屬植物ITS 鄰接樹，Bootstrap ＝1000Fig.2 9 species of Aconitum ITS neighbor tree， Bootstrap ＝1000

3.3 ITS1、ITS2 一致性二級結(jié)構(gòu)

二級結(jié)構(gòu)不同顏色的堿基配對代表此處有不同數(shù)量的配對類型，而顏色的深淺則代表此配對在所有組內(nèi)種中的保守性，顏色越淺則此配對在組內(nèi)的差異越大(圖3). ITS1 與ITS2 的二級結(jié)構(gòu)上都是一個多分枝環(huán)，周圍有4 條螺旋臂(Helix).從圖3 中的結(jié)果顯示ITS1 比ITS2 的配對穩(wěn)定性小，9 種烏頭屬植物ITS1 變異位點(diǎn)有89 個，占35%，ITS2 變異位點(diǎn)有53個，占23%，表明ITS1 比ITS2 區(qū)域有更高的進(jìn)化速率.

圖3 最小自由能預(yù)測的ITS1、ITS2 一致性二級結(jié)構(gòu)Fig.3 ITS1， ITS2 consistent secondary structure with minimum free energy prediction

3.4 ITS1 二級結(jié)構(gòu)分析

所有種都有1 ～2 個多分枝環(huán)結(jié)構(gòu)，四個主要的螺旋臂，三個較長的螺旋臂，1 ～4 個較短的螺旋臂(圖4).ZY(遵義)的有兩個明顯的主環(huán)，三個較長的螺旋臂，三個較短的螺旋臂.XJ(新疆)的為中心兩個較小的分枝環(huán)，三個主要的長螺旋臂，三個短螺旋臂.BSJ(白水江)的兩個分枝環(huán)都在靠近臂I 與臂IV 處，同樣有3 條長螺旋臂，短螺旋臂較其他的多. 所有的都在臂II 處中間有兩個小環(huán)，臂長也大致相同，暗示此段可能為烏頭屬的特有結(jié)構(gòu).

圖4 ITS1 的二級結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of ITS1

3.5 ITS2 二級結(jié)構(gòu)分析

在ITS2 Database 上預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，得到9 個序列的二級結(jié)構(gòu)圖(圖5).結(jié)構(gòu)符合被子植物一環(huán)(主環(huán))四臂(4 個螺旋區(qū))的特征，在臂I 和臂IV 之間有一段比較保守的、富含嘌呤的單鏈結(jié)構(gòu). XE(宣恩)和LC01(利川)的臂IV 上有2 個環(huán)，其他為1 個環(huán)；XJ(新疆)的差異最為明顯，主環(huán)呈現(xiàn)分裂狀，臂II 上為4 個環(huán)，臂III 中部有一個較大的環(huán)；QCHS(青城后山)的臂I 和臂IV 之間單鏈長度最短.從整體結(jié)構(gòu)上來看，SNJ(神農(nóng)架)、TBS(太白山)、LC01(利川)、LJL01(利川)具有高度相似性，在臂III 上都是一個凸出環(huán)與5 個小環(huán)，在臂IV 末端都為一個環(huán)且大小一致，從二級結(jié)構(gòu)上可以把這4 種歸為一類；因此可從二級結(jié)構(gòu)的環(huán)數(shù)與長度來區(qū)分這幾種烏頭.

將ITS2 序列與二級結(jié)構(gòu)信息導(dǎo)入4SALE 軟件后，比對后，統(tǒng)計(jì)CBCs 位點(diǎn)信息. TBS(太白山)與QCHS(青城后山)和SNJ(神農(nóng)架)的CBCs 位點(diǎn)都為2，從ITS 一級結(jié)構(gòu)來看，TBS(太白山)與QCHS(青城后山)和SNJ(神農(nóng)架)位于牛扁亞屬的不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn).在ITS 一級結(jié)構(gòu)中，ZY(遵義)與其他各地烏頭親緣關(guān)系都比較遠(yuǎn)，但在二級結(jié)構(gòu)與BSJ(白水江)、LC01(利川)、LC02(利川)、LJL01(老界嶺)、XE(宣恩)存在CBCs 位點(diǎn). LJL02(老界嶺)的CBCs位點(diǎn)較LJL01 都多1 個，除了與TBS 的為0.詳細(xì)信息見表5.

圖5 ITS2 二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure of ITS2

表5 CBCs 位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 5 CBCs site statistics

4 討論

在生物系統(tǒng)進(jìn)化的過程中，高級結(jié)構(gòu)與功能有更加密切的聯(lián)系，通過ITS1 一級結(jié)構(gòu)與ITS2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測來闡明它們的親緣關(guān)系是十分必要的. 同時，已有研究表明ITS2 對系統(tǒng)進(jìn)化樹的誤差進(jìn)行更精確的修正重構(gòu)是可行有效的[23]，在許多以二級結(jié)構(gòu)分析為工具來進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化的研究中，RNA 的折疊結(jié)構(gòu)常用來改善多序列的比對.雖然序列比對的結(jié)果還不夠完全正確，但這種方法確實(shí)能夠提高序列比對的準(zhǔn)確性，加強(qiáng)系統(tǒng)發(fā)育的重建.

本研究中的9 個材料顯示，ITS1 與ITS2 一級結(jié)構(gòu)顯示GC 含量都高于60%，ITS1 的變異位點(diǎn)數(shù)高于ITS2，ITS1 簡約信息位點(diǎn)占12.4%，ITS2 簡約信息位點(diǎn)9%. 同時ITS1 與ITS2 的一致性二級結(jié)構(gòu)表明，ITS2 的堿基配對穩(wěn)定性更高，ITS1 的結(jié)構(gòu)變化更大.綜合一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的比對情況，認(rèn)為ITS1 的結(jié)構(gòu)變異程度高于ITS2 的結(jié)構(gòu)變化，ITS2 序列具有更高進(jìn)化保守性.

ITS 一級結(jié)構(gòu)的聚類及遺傳距離顯示，ZY 烏頭與其他8 種的聚類親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，遺傳距離最大，從亞屬水平上即區(qū)分開，BSJ 烏頭與XJ 烏頭在一級結(jié)構(gòu)上也明顯區(qū)分開，與形態(tài)學(xué)分類一致. 通過對9 種烏頭屬植物的ITS 序列觀察可以發(fā)現(xiàn):種間的遺傳距離都較小，低于0.1 反映了種間的遺傳相似性，LJL01與LJL02 序列之間微小的差異可能是由于種內(nèi)遺傳的多態(tài)性所致.6 個產(chǎn)地的高烏頭，分為兩大類，從ITS 一級結(jié)構(gòu)來看，BSJ(白水江)、TBS(太白山)、LJL(老界嶺)的聚為一支，相互之間遺傳距離小于0.04，這3 種位于秦嶺區(qū)域，QCHS(青城后山)、LC(利川)、XE(宣恩)、SNJ(神農(nóng)架)聚為一支，兩兩之間遺傳距離小于0.03，分布地位于武陵山區(qū)，推測高烏頭植物在進(jìn)化過程中，受地理環(huán)境的影響產(chǎn)生明顯的遺傳差異；同時從ITS1 二級結(jié)構(gòu)來看，BSJ(白水江)、TBS(太白山)、LJL(老界嶺)具有高度的相似性，LC(利川)、XE(宣恩)、SNJ(神農(nóng)架)的二級結(jié)構(gòu)形態(tài)上能明顯區(qū)分開；CBCs 位點(diǎn)結(jié)果表明這兩支的高烏頭之間存在多個CBCs 位點(diǎn)，種間雜交率極低，進(jìn)而驗(yàn)證了這一推測.此前根據(jù)ITS 來區(qū)分不同種烏頭屬植物，雖然能相互區(qū)分，但是對于種間的區(qū)分有限，因此在利用ITS 區(qū)分烏頭屬植物時有必要考慮不同地區(qū)的ITS 特征，即可以用于道地藥材的鑒定.

通過對ITS1 與ITS2 的二級結(jié)構(gòu)分析比對，不同種具有不同的二級結(jié)構(gòu)特點(diǎn). ITS1 的螺旋臂II 環(huán)數(shù)與臂長類似，主要的差異在于分枝環(huán)的大小和位置.ITS2 的二級結(jié)構(gòu)差異主要在螺旋臂I 與IV 之間的單鏈結(jié)構(gòu)，螺旋臂II 和III 類似.因此認(rèn)為可以用二級結(jié)構(gòu)不同特點(diǎn)來區(qū)分不同烏頭屬植物.

根據(jù)Coleman 和Vacquier(2002)提出的CBCcriterion 假說，當(dāng)兩個種間有足夠的進(jìn)化距離累積產(chǎn)生即使一個CBC 在ITS2 二級結(jié)構(gòu)的保守區(qū)域上時，它們無法雜交產(chǎn)生后代.9 種烏頭兩兩組合時，54.5%的組合無CBCs 位點(diǎn)，即種間雜交概率高，38%的組合存在1 個CBCs 位點(diǎn)，即無法雜交產(chǎn)生后代，這個結(jié)果表明本文中用到的材料存在一定的種間雜交.同時根據(jù)以往的烏頭屬植物研究表明，烏頭屬植物在形態(tài)上類似，并且受環(huán)境影響大，即使是同一個種在草地上生長則為直立莖狀，在林地下則為纏繞藤蔓狀，僅從形態(tài)上鑒定容易出錯，特別是炮制后的中藥材更易產(chǎn)生摻假現(xiàn)象，因此從分子水平上鑒定，具有更加準(zhǔn)確的效果.

ZY 的形態(tài)學(xué)鑒定為白喉烏頭，依據(jù)中國植物志中記載，白喉烏頭在烏頭屬分類中屬于牛扁亞屬. 而在本研究中9 個地區(qū)的親緣關(guān)系比較中，無論是一級結(jié)構(gòu)比對，還是二級結(jié)構(gòu)分析，ZY 的親緣關(guān)系最遠(yuǎn).在一級結(jié)構(gòu)中ZY 與烏頭亞屬植物聚為一類，其形態(tài)上又與牛扁亞屬植物接近，推測可能是地理環(huán)境導(dǎo)致了此種形態(tài)學(xué)上的變化；或者從演化進(jìn)程上來看，牛扁亞屬位于較原始的類群，其次是烏頭亞屬，最后是露蕊烏頭亞屬，ZY 形態(tài)上與牛扁亞屬相似，序列上又與烏頭亞屬的聚為一類，因此推測此種可能是從牛扁亞屬到烏頭亞屬的過渡，但這個推測還需進(jìn)一步驗(yàn)證.后續(xù)將從烏頭堿含量來鑒定遵義烏頭，為ZY 烏頭的道地性提供分子證據(jù)與成分含量依據(jù).