土壤nirS、nosZ 型反硝化菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性對牛場肥水灌溉水平的響應(yīng)

高文萱，閆建華，杜會英，張克強*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2.天津大學化工學院，天津 300072）

規(guī)?；?、集約化的畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了大量養(yǎng)殖廢水，相對固體糞便來說，養(yǎng)殖廢水處理和利用率極低，嚴重制約了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因養(yǎng)殖廢水含豐富的腐植酸等有機質(zhì)和氮、磷等植物營養(yǎng)元素[1-2]，直接排放會對環(huán)境造成水體富營養(yǎng)化的污染。在我國生態(tài)型畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的指導下，將養(yǎng)殖廢水進行厭氧生物降解處理，產(chǎn)生的沼液養(yǎng)分全面作為一種優(yōu)質(zhì)的有機肥料源以肥水方式回歸土壤，既有效利用養(yǎng)殖廢水減少資源浪費，又避免直接排放養(yǎng)殖廢水對環(huán)境的污染，是最佳的廢水處理和利用途徑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有很好的應(yīng)用前景[3]。因此，在提倡生態(tài)農(nóng)業(yè)的今天，如何以沼液作為水肥安全高效地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，成為眾多學者的研究方向[4-5]。

反硝化過程與土壤氮素損失和溫室氣體排放密切相關(guān)，是施肥和土壤研究中的重點問題[6]。有研究者估計，全球70%的N2O排放來自農(nóng)田，其中農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的排放量約占25%[7]；此外，反硝化作用致使土壤喪失20%～30%的氮肥，是土壤肥力下降的重要原因[8]。反硝化是在硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、NO還原酶和N2O還原酶連續(xù)催化下將NO-3還原為N2的過程。其中亞硝酸鹽還原酶（Nir）是反硝化作用中最關(guān)鍵的一步反應(yīng)，因而其編碼基因（nir）在反硝化研究中被廣泛用作分子標記[9]。亞硝酸還原酶分為cd1-亞硝酸還原酶和Cu-亞硝酸還原酶兩種，分別由nirS和nirK基因編碼，兩者不能共存于一種微生物中[10]，nirS基因在反硝化菌中的存在比nirK更廣泛[10]。nirK基因存在于許多親緣關(guān)系較遠的菌株中，且分子量變化較大；而含有nirS基因的細菌以假單胞菌占優(yōu)勢，且在不同菌株中分子大小相似，形態(tài)結(jié)構(gòu)相對保守[11]。由nosZ基因編碼的N2O還原酶催化N2O轉(zhuǎn)化成N2，是反硝化過程的最后一步，對于減少N2O的排放意義重大[12-13]。

本研究以華北地區(qū)小麥-玉米輪作大田為研究對象，采用T-RFLP技術(shù)分析了不同牛場肥水濃度和灌溉次數(shù)下0～20 cm以及20～40 cm土層中nirS和nosZ群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化，為牛場肥水的合理施用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2012年10月至2015年6月進行，采樣地點為河北省保定市徐水縣梁家營長期定位牛場肥水灌溉試驗田（115°32′6.67″E，38°56′43.63″N），土壤類型為潮褐土。徐水縣位于太行山東麓，河北省中部，屬暖溫帶季風型大陸性氣候，四季分明，光照充足，海拔1200～2768 m，年平均氣溫12.3℃，年無霜期平均184 d，年均降水量546.9 mm，年日照時數(shù)平均2 744.9 h，屬華北平原典型農(nóng)業(yè)種植區(qū)。冬小麥-夏玉米輪作為當?shù)刂饕霓r(nóng)業(yè)種植方式，當年10月上旬種植冬小麥，次年6月中旬收獲小麥，約一周后種植夏玉米，當年9月底收獲，玉米秸稈用于奶牛的飼養(yǎng)。該地區(qū)奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達，奶牛場41座，奶牛存欄數(shù)達到2.5×104頭，每年排放廢水5×105t。試驗地種植前耕層土壤有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)24.5 g·kg-1、pH值7.76、全氮質(zhì)量分數(shù)1.39 g·kg-1、硝態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)13.09 mg·kg-1、銨態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)2.24 mg·kg-1、速效磷質(zhì)量分數(shù)64.19 mg·kg-1。試驗土壤主要理化性質(zhì)見表1。

1.2 試驗設(shè)計與樣品采集

試驗共設(shè)8個處理，表2為各處理下的施肥時間、類型及成分。每處理設(shè)置3次重復，24個田間小區(qū)采用完全隨機區(qū)組排列。每個小區(qū)長9 m，寬6 m，面積54 m2。試驗小區(qū)灌溉采用畦灌，根據(jù)《華北地區(qū)冬小麥公頃產(chǎn)量6000 kg（畝產(chǎn)400 kg）栽培技術(shù)規(guī)程》（NY/T 205—1992），計算冬小麥需水量，所有處理灌水定額均為830 m3·hm-2，灌水量利用超聲波流量計計量，灌溉誤差1%以內(nèi)。冬小麥全生育期灌水4次，玉米生育期灌水1次。供試冬小麥品種為濟麥22、玉米為農(nóng)大221。試驗灌溉用牛場肥水為經(jīng)過厭氧處理的牛糞尿和擠奶車間沖洗水，經(jīng)檢測符合《農(nóng)田灌溉水質(zhì)標準》（GB 5084—2005），表3為厭氧處理后的灌溉肥水原液成分及含量。

表1 試驗土壤基本性質(zhì)Table 1 Soil basic properties

表2 各個處理施肥量Table 2 Fertilizer amount in treatments

土壤樣品的采集：樣品采自小麥收獲期（2015年6月12日），采集深度為0～20、20～40 cm兩個土層。采用五點取樣法，每個實驗小區(qū)處理中采集5個土樣，將5點采集的土壤混合為1個樣品。田間采集的土樣保存于保鮮盒內(nèi)并迅速送至實驗室，于實驗室內(nèi)將土樣去除根系、雜草等雜質(zhì)后混勻，-20℃冷凍保存用于土壤微生物分析。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤總DNA的提取

土壤DNA的提取采用FastDNA SPIN Kit For Soil（MP Biomedicals，LLC）試劑盒方法。稱取500 mg的土壤樣品，按試劑盒提供的操作步驟進行，以Fast-Prep?Instrument進行細胞破碎處理，速度為6 m·s-1，時間40 s。提取的DNA在0.7%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。DNA保存于-20℃的冰箱中備用。

1.3.2 反硝化菌群落結(jié)構(gòu)分析

反硝化菌群落結(jié)構(gòu)分析采用末端限制性酶切片段長度多態(tài)性方法分析（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP），利用反硝化菌nirS、nosZ基因特異引物進行PCR擴增（表4）。PCR產(chǎn)物用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0（TaKaRa）試劑盒進行純化回收，回收后的目的基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶HhaI（TaKaRa）酶切分析。酶切后所得產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行毛細管電泳檢測。將獲得的T-RFLP數(shù)據(jù)繼續(xù)進行處理，去除結(jié)果中小于50 bp及相對豐度小于1%的酶切片段。

1.3.3 序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將各處理下的PCR擴增產(chǎn)物均勻混合，經(jīng)切膠回收后連接至pMD19?-T Vector質(zhì)粒（Takara，大連）、轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞DH5a內(nèi)，37℃過夜培養(yǎng)，經(jīng)藍白斑篩選，挑取約100個陽性克隆子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析，構(gòu)建克隆文庫。將測序所得序列利用Vector NTI 11.5.1軟件分析檢查去除嵌合及錯誤序列后，在GeneBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.com）中進行Blast比對。

表3 灌溉肥水原液成分及含量Table 3 The composition and content of cattle fertilizer biogas slurry

表4 PCR反應(yīng)中的引物及反應(yīng)條件Table 4 Primers and PCR conditions used for the PCR amplification

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

群落結(jié)構(gòu)分析通過計算3個群落多樣性指數(shù)（Diversity index）：香農(nóng)維納指數(shù)（Shannon-Wiener index）、辛普森優(yōu)勢度指數(shù)（Simpson index）、均勻性指數(shù)（Pielou index）。式中：Pi表示某個峰的峰面積占該樣點所有峰的總面積的比例；S表示T-RFs（T-RFs表示末端限制性片段）的個數(shù)。T-RFLP片段分布的影響的顯著性采用SPSS 17.0（IBM SPSS）單因素方差分析檢驗，并進行多重比較。利用CANOCO 4.5（Ter Braak&Smilauer，2012）基于T-RFLP圖譜中酶切片段的數(shù)值進行兩土層中反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析（PCA）。系統(tǒng)發(fā)育分析采用 MEGA 5.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis），根據(jù)BLAST同源性比對的結(jié)果，從核酸數(shù)據(jù)庫中下載同源性高的不同分類來源的代表性nirS、nosZ序列，用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建nirS、nosZ反硝化細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對兩土層nirS型反硝化菌群落的影響

利用反硝化細菌nirS基因特異引物對兩土層反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)進行T-RFLP分析，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)HhaI酶切后，0～20 cm和20～40 cm土層分別得到22種和27種片段長度，兩土層中都存在著豐富的nirS型反硝化細菌基因資源。0～20 cm土層中nirS基因酶切片段 68、83、102、112、160、166、169 bp和206 bp占全部片段百分比含量的75.60%～83.26%，為主要優(yōu)勢片段。不同肥水處理對0～20 cm土層中nirS型反硝化菌相對豐度均無顯著差異，說明0～20 cm土層中nirS型反硝化細菌對施肥種類、肥水濃度及灌溉次數(shù)等不同處理條件不敏感。20～40 cm土層中nirS基因代表的反硝化微生物群落組成在各施肥處理下發(fā)生變化，經(jīng)HhaI酶切后均得到6個主要片段68、98、112、160、166 bp和169 bp，占全部片段百分比含量的46.99%～60.85%，說明這些片段所代表的nirS型反硝化細菌在土壤中占優(yōu)勢。不同處理下6個主要片段相對豐度未發(fā)生明顯變化，但CF、T1、T2、T4和T5處理下出現(xiàn)片段58 bp且相對豐度較高，片段185 bp在T3處理下相對豐度顯著增加，片段83 bp比例在T4處理下相對豐度顯著增加，這些片段均上升為優(yōu)勢菌種；T1和T2處理下片段317 bp相對豐度明顯增加；T2、T4和T6處理下片段126 bp相對豐度顯著降低。

比較兩土層nirS型反硝化菌群落組發(fā)現(xiàn)，0～20 cm土層中片段102 bp相對豐度在各處理下平均為17.13%，顯著高于20～40 cm土層（1.55%）；20～40 cm的土層中出現(xiàn)了0～20 cm土層中沒有的76、91、98、105、126、235 bp新片段，其中98 bp和126 bp在各處理下的相對豐度較高，分別占11.31%、3.91%。上述T-RFLP結(jié)果表明，nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)在0～20、20～40 cm土層中存在一定的垂直分布差異，且0～20 cm土層中nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)對施肥種類、肥水濃度及灌溉次數(shù)不敏感，而20～40 cm土層中nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)對施肥條件敏感性提高。

對不同處理下兩土層中nirS型反硝化菌群落多樣性指數(shù)分析（表5）發(fā)現(xiàn)，無論是0～20 cm土層還是20～40 cm土層，大多數(shù)處理下nirS型反硝化菌的Shannon-Wiener H′指數(shù)、Simpson D指數(shù)和Pielou E指數(shù)沒有顯著的差別，表明實驗條件下施肥種類及方式（肥水灌溉）對nirS基因多樣性影響不顯著。

根據(jù)nirS基因T-RFs數(shù)據(jù)進行主成分分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，在0～20 cm土層中，第一主成分（PC1）解釋了37.2%的物種組成變化，第二主成分（PC2）解釋了22.2%的物種組成。其中，CF與CK較為接近，而其他牛場肥水處理點與CK相距較遠，說明肥水處理組對0～20 cm土層中nirS群落結(jié)構(gòu)影響比常規(guī)施肥CF更大。在20～40 cm土層中，第一主成分（PC1）解釋了31.0%的物種組成變化，第二主成分（PC2）解釋了25.1%的物種組成。所有處理點均遠離CK，其中T5、T6與CF較為接近，說明施肥處理使20～40 cm土層中nirS群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中T5、T6處理下nirS群落結(jié)構(gòu)與常規(guī)施肥CF較為接近。

2.2 不同施肥處理對兩土層nirS型反硝化菌系統(tǒng)進化分析

基于T-RFLP圖譜中處理的片段長度的數(shù)量和比例的均勻性，選取0～20 cm和20～40 cm土層nirS基因建立克隆文庫，在兩土層nirS基因文庫中均選取約100個克隆子測序，通過登陸NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，剔出假陽性克隆，與Genbank數(shù)據(jù)庫中已存在的序列進行同源性比對，最終獲得了42個有代表性的操作分類單元（OTUs），進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖3所示，測序獲得的nirS序列與其相似菌株的相似性在84%～99%之間。

圖1 不同處理條件下nirS型反硝化菌的T-RFLP圖譜Figure 1 T-RFLP fingerprints of nirS gene from soils under different regimes

表5 不同施肥水平處理下兩土層nirS基因多樣性指數(shù)Table 5 The diversity index of soil nirS denitrifying bacteria under different fertilizer treatments

根據(jù)序列在進化樹上的分布，將nirS基因系統(tǒng)發(fā)育樹分為4個類群：其中，總克隆的46.3%分布在第Ⅰ個類群，主要包括0～20 cm土層的優(yōu)勢菌群102 bp（19）、166 bp（11）和20～40 cm土層的優(yōu)勢菌群98 bp（11）、112 bp（7）、160 bp（14），在系統(tǒng)進化樹中，這些序列與β-變形菌綱的貪銅菌屬（Cupriavidus）、Thau-era菌屬和γ-變形菌綱的假單胞菌屬（Pseudomonas）聚類在一起，有較近的親緣關(guān)系。23.2%的克隆分布在第Ⅱ個類群，主要包括0～20 cm土層的優(yōu)勢菌群160 bp（6）、169 bp（6）和20～40 cm土層的優(yōu)勢菌群169 bp（6），這些序列與α-變形菌綱的副球菌屬（Paracoccus）和γ-變形菌綱的Rhodanobacter聚類在一起，有較近的親緣關(guān)系。11.2%的克隆分布在第Ⅲ個類群，此類群中20～40 cm土層的反硝化菌占到11.05%，包括20～40 cm土層的優(yōu)勢菌群50 bp（8）、166 bp（13），而0～20 cm土層僅占0.15%，與此類群相近的微生物為β-變形菌綱的Brachymonas、Alicycliphilus菌屬。18.9%的克隆分布在第Ⅳ個類群，主要包括0～20 cm土層的優(yōu)勢菌群112 bp（5）和20～40 cm土層的優(yōu)勢菌群68 bp（9），與此類群相近的微生物為β-變形菌綱的固氮弧菌屬（Azoarcus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）、Ralstonia菌屬和γ-變形菌綱的Serratia菌屬。

2.3 不同施肥處理對兩土層nosZ型反硝化菌群落的影響

利用反硝化細菌nosZ基因特異引物對兩土層反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)進行T-RFLP分析，結(jié)果如圖4。在0～20 cm土層中nosZ基因經(jīng)HhaI酶切得到16個T-RFs片段。不同處理下片段59、177 bp和265 bp均出現(xiàn)且相對豐度較高，是共有的優(yōu)勢菌種，且在各處理下相對豐度無顯著變化。另外，片段54 bp在T2、T3、T4、T5和T6處理下相對豐度明顯上升，為優(yōu)勢菌種；片段91 bp在T5處理下相對豐度顯著增加，也成為該處理下的優(yōu)勢菌種；片段111 bp在T1、T3和T4處理下相對豐度顯著增加，成為該處理下的優(yōu)勢菌種；片段117 bp在除T2和T6處理外的其他處理中相對豐度均較高，為其他處理的優(yōu)勢菌種，不同施肥處理下0～20 cm土層nosZ型反硝化菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

20～40 cm土層中nosZ基因經(jīng)HhaI酶切產(chǎn)生了20個T-RFs片段，種類較0～20 cm土層豐富。片段111、265 bp在所有處理中均存在且相對豐度較高，是共有優(yōu)勢菌種。片段63 bp在CF、T1、T2、T3和T4處理下相對豐度明顯增加，成為這些處理下的優(yōu)勢菌種；片段111 bp在T1處理下相對豐度顯著增加；片段125 bp在T3和T4處理下相對豐度顯著增加，成為優(yōu)勢菌種；片段84、155 bp和194 bp在T5處理下相對豐度明顯增加，成為該處理下的優(yōu)勢菌種。片段63 bp在T6處理下相對豐度明顯減少，而片段155 bp和194 bp相對豐度相對增加，成為優(yōu)勢菌種。綜上可知，不同施肥處理下20～40 cm土層nosZ型反硝化菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。另外，比較兩土層發(fā)現(xiàn)20～40 cm土層中出現(xiàn)0～20 cm土層中沒有的片段63、111、84、87、125 bp和205 bp，且相對豐度較高，表明相同施肥條件下土壤0～20 cm與20～40 cm土層nosZ型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。

圖2 不同施肥處理下兩土層中nirS型反硝化菌群落的PCA分析Figure 2 The PCA analysis of nirS denitrifying bacteria under different fertilizer treatments in soils

圖3 nirS型反硝化菌系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）Figure 3 Neighbour-joining phylogenetic tree of nirS gene sequences

對不同處理下兩土層中nosZ型反硝化菌群落多樣性指數(shù)分析（表6）發(fā)現(xiàn)，0～20 cm土層中T5處理下的Shannon-Wiener H′指數(shù)顯著高于T2和T6處理，Simpson D指數(shù)T5也高于T6，Pielou E指數(shù)均無顯著的差別；而20～40 cm土層T5處理下的Shannon-Wiener H′指數(shù)也高于T2和T6處理，但差異不顯著。比較T5（含氮量為 317 kg·hm-2）、T2（含氮量為 210 kg·hm-2）和T6（含氮量為126 kg·hm-2）處理，3個處理均為越冬期和拔節(jié)期灌溉，表明相同灌溉次數(shù)，高濃度肥水灌溉有利于兩土層中nosZ型反硝化菌群落多樣性發(fā)展。另外發(fā)現(xiàn)在20～40 cm土層中，T1處理Shannon-Wiener H′指數(shù)顯著低于其他處理，而T5處理Shannon-Wiener H′指數(shù)顯著高于CK、CF、T1和T4處理，表明T1處理能顯著降低nosZ型反硝化菌群落多樣性，T5處理相對其他處理更有助于增加nosZ群落多樣性。

圖4 不同處理條件下nosZ型反硝化菌的T-RFLP圖譜Figure 4 T-RFLP fingerprints of nosZ genes from soils under different regimes

表6 不同施肥水平處理下兩土層nosZ基因多樣性指數(shù)Table 6 The diversity index of nosZ denitrifying bacteria in soils under different fertilizer treatments

根據(jù)nosZ基因T-RFs數(shù)據(jù)進行主成分分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，在0～20 cm土層中，第一主成分（PC1）解釋了59.5%的群落結(jié)構(gòu)變化，第二主成分（PC2）解釋了16.1%的群落結(jié)構(gòu)變化。CF、T2和T6處理在PC1上距離CK較遠，而T1、T3、T4和T5處理則在PC1上較為接近CK，說明T2、T3、T4和T5處理使0～20 cm土層中nosZ群落結(jié)構(gòu)變化較小，而T2和T6處理nosZ群落結(jié)構(gòu)變化較大，nosZ群落結(jié)構(gòu)展示出對肥水濃度及灌溉次數(shù)的敏感性。在20～40 cm土層中，第一主成分（PC1）解釋了68.1%的物種組成變化，第二主成分（PC2）解釋了16.2%的物種組成變化。T5在PC1和PC2上最接近CK，說明T5處理對20～40 cm土層nosZ群落結(jié)構(gòu)影響較??；T2、T3、T4與CF聚成一簇，說明這幾個處理nosZ群落結(jié)構(gòu)相似。

2.4 不同施肥處理對兩土層nosZ型反硝化菌系統(tǒng)進化分析

基于T-RFLP圖譜中處理的片段長度的數(shù)量和比例的均勻性，選取0～20 cm和20～40 cm土層nosZ基因建立克隆文庫，在兩土層nosZ基因文庫中均選取約100個克隆子測序，通過登陸NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，剔出假陽性克隆，與Genbank數(shù)據(jù)庫中已存在的序列進行同源性比對，最終獲得了35個有代表性的操作分類單元（OTUs），進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖6所示，測序獲得的nosZ序列與其相似菌株的相似性在85%～99%之間。

圖5 不同施肥處理下兩土層中nosZ型反硝化菌群落的PCA分析Figure 5 The PCA analysis of nosZ denitrifying bacteria under different fertilizer treatments in soils

根據(jù)序列在進化樹上的分布，將nosZ基因系統(tǒng)發(fā)育樹分為4個類群：其中，總克隆的39.7%分布在第Ⅰ個類群，主要包括0～20 cm土層的優(yōu)勢菌群54 bp（8）、59 bp（11）、177 bp（13）、265 bp（20）和 20～40 cm土層的優(yōu)勢菌群177 bp（7），另外包括兩個土層的次優(yōu)勢種群（如：0～20 cm土層的66、98 bp；20～40 cm土層的54、98、155、160 bp和255 bp等），在系統(tǒng)進化樹中，這些序列與α-變形菌綱的根瘤菌屬（Rhizobium）和固氮螺菌屬（Azospirillum）、β-變形菌綱的貪銅菌屬（Cupriavidus）和γ-變形菌綱的假單胞菌屬（Pseudomonas）、絲硫菌屬（Thiothrix）聚類在一起，有較近的親緣關(guān)系。15.1%的克隆分布在第Ⅱ個類群，主要包括0～20 cm土層的54 bp（8）、87 bp（2）、91 bp（3）、111 bp（6）、136 bp（1）和20～40 cm土層的102 bp（3）、125 bp（4），這些序列與α-變形菌綱的中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）和γ-變形菌綱的志賀氏菌屬（Shigella）聚類在一起，有較近的親緣關(guān)系。30.2%的克隆分布在第Ⅲ個類群，主要包括20～40 cm土層的優(yōu)勢菌群63 bp（9）、265 bp（14），此外還包括有Z1-226 bp（3）、Z1-255 bp（1）、Z1-194 bp（6）片段，Z2-226 bp（2）、Z2-265 bp（14）、Z2-63 bp（9）、Z2-87 bp（7）、Z2-91 bp（5）、Z2-194 bp（7）、Z2-74 bp（4）等片段，與此類群相近的微生物為γ-變形菌綱的假單胞菌屬（Pseudomonas）。15.1%的克隆分布在第Ⅳ個類群，主要包括20～40 cm土層的優(yōu)勢菌群111 bp（9），此外還包括有Z1-230 bp（1）、Z1-144 bp（3）、Z2-144 bp（2）、Z2-74 bp（4）、Z2-117 bp（2）、Z2-167 bp（1）、Z2-84 bp（5）等片段，與此類群相近的微生物為γ-變形菌綱的Steroidobacter菌屬和Pluralibacter菌屬。

3 討論

反硝化作用是在微生物參與下的土壤氮循環(huán)中的一個重要過程，反硝化作用強弱直接影響著氮素的利用[14]。杜會英等[15]研究發(fā)現(xiàn)，牛場肥水灌溉使冬小麥-夏玉米輪作體系作物累計氮利用率逐年升高，且顯著高于常規(guī)化肥處理。然而農(nóng)田施用氮肥會導致溫室氣體N2O的排放，通過管理氮肥的種類及用量則可在一定程度上控制N2O的排放[16]。沈仕洲等[17]研究發(fā)現(xiàn)，采用不同濃度奶牛場沼液灌溉都使N2O排放較清水增加，但不高于常規(guī)化肥排放值?？梢?，牛場肥水灌溉可能通過調(diào)節(jié)土壤反硝化過程提高了氮素利用率。

溫度、pH、水分、含氧量、碳氮類型和碳氮比以及土壤質(zhì)地、土壤利用和耕作方式等都對反硝化作用產(chǎn)生影響[14，18]。本研究各試驗田的光照、土壤、作物、種植方式、灌溉次數(shù)與灌溉水量均相同，不同施肥方式主要通過pH、碳氮類型和碳氮量對反硝化微生物產(chǎn)生影響。因采用了長期定位試驗田，施肥模式從2012年10月持續(xù)到2015年6月，土壤性質(zhì)因長期的施肥措施產(chǎn)生了一定差異（表1），施肥處理組（CF，T1～T6）的-N和-N普遍高于不施肥處理CK，這種差異反映了施肥措施的長期影響；同樣，反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)的改變也反映了在施肥措施影響下的長期適應(yīng)結(jié)果。本研究中nirS型反硝化細菌主要與假單胞菌屬（Pseudomonas）、副球菌屬（Paracoccus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）具有較近的親緣關(guān)系；而nosZ型反硝化細菌與假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、貪銅菌屬（Cupriavidus）等具有較近的親緣關(guān)系，這些菌屬與已知報道吻合[14，18]。

圖6 nosZ型反硝化菌系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）Figure 6 Neighbour-joining phylogenetic tree of nosZ gene sequences

現(xiàn)有報道nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)對施肥條件的響應(yīng)存在矛盾，如宋亞娜等[19]研究發(fā)現(xiàn)施用氮肥對稻田土壤的nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)沒有明顯影響；Yin等[20]發(fā)現(xiàn)，我國南方水稻土中nirS型反硝化菌的群落結(jié)構(gòu)對施加無機肥和有機肥處理均沒有顯著的響應(yīng)；另一些研究則表明nirS對施肥有明顯響應(yīng)，如莫旭華等[21]發(fā)現(xiàn)，不同類型的反硝化細菌對無機氮肥的反應(yīng)不同而導致了nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)改變，但未改變nirS型反硝化細菌的多樣性；王婷等[22]研究發(fā)現(xiàn)牛場肥水施用改變了0～5 cm表層土中nirS型反硝化細菌的多樣性。本研究發(fā)現(xiàn)施肥種類及施肥方式對0～20 cm土層nirS型反硝化細菌群落組成無顯著影響，但對20～40 cm土層nirS型反硝化細菌有一定影響，這與前述兩種報道都有吻合之處。這可能是由于nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)更易受土壤異質(zhì)性（土層深度）的影響。本研究還發(fā)現(xiàn)施肥措施的不同對兩土層nosZ型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的影響，nosZ型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)對施肥種類及施肥方式更為敏感。有研究顯示nirS基因的分布與樣品所處的環(huán)境類型有關(guān)，nirS基因序列在不同的環(huán)境類型中存在的差異非常大，即使在土壤環(huán)境相同的情況下，nirS基因的序列也存在很大的不同[23]；另外，Ishii等[24]研究亦發(fā)現(xiàn)對土壤環(huán)境變化響應(yīng)的反硝化菌種群具有土壤的特異性，這在一定程度上解釋了兩土層中nirS型反硝化菌對不同施肥處理的不同響應(yīng)。兩土層nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)對施肥條件的響應(yīng)是綜合了0～20 cm和20～40 cm土層不同環(huán)境因素影響的結(jié)果，如水分、NO-3-N含量和氧分壓等因素，本實驗中施肥條件下兩土層土壤水分含量相近，可見水分不是導致兩土層中施肥條件下nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)特征變化不同的原因。土壤中反硝化細菌的分布與土壤環(huán)境中NO-3-N濃度及氧分壓密切相關(guān)[25-26]，NO-3-N是反硝化作用的底物，本實驗中施肥條件下兩土層的NO-3-N含量變化差異明顯，另外20～40 cm土層較之0～20 cm氧分壓明顯較低，施肥處理下土壤低氧含量的20～40 cm土層環(huán)境可能更適合nirS型反硝化細菌的生存，使得適合在該環(huán)境條件下生存的反硝化細菌的種類及豐度增加，逐漸取代了數(shù)量較少且不適宜在該環(huán)境下生存的反硝化細菌，從而成為優(yōu)勢種群并發(fā)揮重要作用[27]，所以NO-3-N含量和氧分壓等綜合因素的影響可能是導致兩土層中施肥條件下nirS、nosZ型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)特征變化不同的原因。

對nirS、nosZ基因的多樣性指數(shù)的研究顯示實驗條件下施肥種類及方式對nirS、nosZ基因多樣性指數(shù)影響不同。不同施肥處理條件下兩土層nosZ型反硝化細菌群落組成受肥水灌溉及灌溉次數(shù)等的環(huán)境變化影響顯著，說明土壤nosZ型反硝化微生物群落多樣性指數(shù)受到施肥的影響，這與之前研究相一致，如Enwall等[28-29]研究發(fā)現(xiàn)nosZ型反硝化細菌的群落對有機肥敏感，氮肥可導致nosZ型反硝化細菌多樣性降低，Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)長期單施氮肥可提高nosZ基因型反硝化細菌群落多樣性，Patrick等[31]研究發(fā)現(xiàn)nosZ型反硝化細菌的多樣性和豐度隨著氮輸入的增加而增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，盡管不同施肥處理改變了20～40 cm土層nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)，但并未對多樣性造成顯著改變，說明這種改變主要是優(yōu)勢菌群與劣勢菌群位置的互換，并未顯著增加菌群的種類，因此整體多樣性改變不大。另外不同施肥處理條件下土壤nosZ型反硝化微生物群落多樣性指數(shù)影響也存在差異，相同施氮量（約300 kg·hm-2）的CF、T5和T3處理下相比常規(guī)施肥處理較高濃度肥水灌溉（T5）能更好地促進兩土nosZ基因多樣性發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)0～20 cm土層中的nirS、nosZ基因的3個多樣性指數(shù)低于20～40 cm土層，原因可能在于施肥條件下0～20 cm土層中nirS、nosZ型反硝化細菌片段的種類不及20～40 cm土層豐富，反硝化菌可以在厭氧環(huán)境下更好地生存的結(jié)果。

4 結(jié)論

nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)在0～20、20～40 cm土層中存在一定的垂直分布差異，且0～20 cm土層中nirS群落結(jié)構(gòu)對施肥種類、肥水濃度及灌溉次數(shù)不敏感，而20～40 cm土層中nirS群落結(jié)構(gòu)對施肥條件敏感性提高。兩土層nosZ型反硝化細菌群落均對施肥條件較為敏感。

相同灌溉次數(shù)，較高肥水濃度灌溉（T5處理：含氮為317 kg·hm-2，清水∶沼液=1∶1）有利于兩土層中nosZ型反硝化菌群落多樣性發(fā)展，而較低濃度肥水灌溉1次（T1處理：含氮為105 kg·hm-2）顯著降低20～40 cm土層中nosZ型反硝化菌群落多樣性。不同施肥條件不改變兩土層nirS群落多樣性。

本實驗所得到的nirS、nosZ序列均來自細菌中的變形菌綱，主要與α、β、γ-變形菌綱相近，且分布廣泛。