透骨消痛膠囊干預(yù)骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎模型骨重建與炎癥因子變化的研究

張佳慧 李函 陳文列 陳賽楠 鄭良樸 黃云梅 林薇 林如輝 黃美雅 李西海

【摘 要】目的：分析透骨消痛膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎模型骨重建與炎癥因子的影響，為治療骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎提供依據(jù)。方法：建立骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎大白兔模型，取模型兔與正常對(duì)照兔各6只比較，鑒定造模成功。再將正常對(duì)照組與模型對(duì)照組大白兔各12只用生理鹽水灌胃，中藥組大白兔12只用透骨消痛膠囊灌胃；維持4，8周時(shí)，每組各6只取材，檢測(cè)血清骨重建關(guān)鍵因子、骨形成與骨吸收標(biāo)志物以及股骨髁炎癥因子蛋白。結(jié)果：中藥組與模型對(duì)照組比較，堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和骨保護(hù)素（OPG）、破骨細(xì)胞異化因子（RANKL）活性顯著降低，OPG/RANKL比值顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）；白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α顯著降低（P < 0.01或P < 0.05）。結(jié)論：透骨消痛膠囊能下調(diào)過(guò)度的骨重建速率，調(diào)節(jié)異常骨代謝水平，降低炎癥因子水平，改善骨關(guān)節(jié)的軟骨下骨與軟骨變化，延緩骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松；透骨消痛膠囊；骨重建；骨保護(hù)素；破骨細(xì)胞異化因子；炎癥因子；大白兔

【ABSTRACT】Objective：To analyze the effects of Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）on bone reconstruction and inflammatory factors in osteoporotic osteoarthritis model，so as to provide evidences for the treatment of osteoporotic osteoarthritis.Methods：Rabbit models of osteoporotic osteoarthritis were established.Six model rabbits and six normal control rabbits were selected to identify the success of the model.Then rabbits from the normal control group（12 rabbits）and from the model group（12 rabbits）were given intragastric administration of saline.Twelve rabbits in the TCM group were given Tougu Xiaotong Jiaonang in the same way.Respectively after 4 and 8 weeks，6 rabbits in each group were taken to detect the key factorsof bone reconstruction，bone formation and bone resorption markers，and inflammatory factor protein of femoral condyle.Results：Compared with the model group，the activities of alkaline phosphatase，tartrate-resistant acid phosphatase，OPG and RANKL were significantly decreased，the ratio of OPG/RANKL was significantly increased，and the levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were significantly decreased in the TCM group.Conclusion：Tougu Xiaotong Jiaonang can decrease the rate of excessive bone reconstruction，regulate the abnormal bone metabolism and reduce the level of inflammatory factors，thereby improving the changes of subchondral bone and cartilage and delaying the progress of osteoporotic osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis；osteoporosis；Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）；bone reconstruction；osteoprotegerin；osteoclast alienation factor；inflammatory factor；rabbits

近年研究發(fā)現(xiàn)，作為骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，

OA）的重要類型，絕經(jīng)婦女患骨質(zhì)疏松（osteoporotic osteoarthritis，OP）性O(shè)A較多，且隨著年齡增長(zhǎng)不斷升高[1-2]。而我國(guó)人口老齡化問(wèn)題不斷加重，OP性O(shè)A勢(shì)必會(huì)成為一種嚴(yán)重威脅國(guó)民健康的慢性疾病。但目前對(duì)OP性O(shè)A的治療藥物和相關(guān)研究較少，因此，研究OP性O(shè)A的治療藥物及機(jī)制很有必要。

OP性O(shè)A早中期主要的病理特征是軟骨下骨質(zhì)疏松和軟骨結(jié)構(gòu)損傷[3]，并伴隨著炎癥因子、骨代謝水平的改變[4]。通過(guò)觀察骨形成標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）、骨吸收標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）等血清骨代謝水平的變化，可了解包括軟骨下骨等骨組織的新陳代謝情況及藥物的治療效果[4]。骨重建關(guān)鍵因子骨保護(hù)素（OPG）能夠抑制破骨細(xì)胞形成[5]，而破骨細(xì)胞異化因子（RANKL）能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞形成[6]。有研究表明，透骨消痛膠囊可通過(guò)作用于OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)減緩骨重建速率[7]，對(duì)干預(yù)兔OA模型有良好藥效[8-9]。故推測(cè)其也可通過(guò)此系統(tǒng)延緩OP性O(shè)A病理進(jìn)程。

黃云梅等[9]研究顯示，OA中軟骨結(jié)構(gòu)損傷加重與炎癥因子水平增加有關(guān)。此外，已明確白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子參與OP的病理過(guò)程，還可誘發(fā)OP[10-11]。

因此，探討藥物對(duì)OP性O(shè)A模型中軟骨結(jié)構(gòu)損傷的改善作用，有必要檢測(cè)炎癥因子水平的變化。

前期軟骨下骨微細(xì)結(jié)構(gòu)與軟骨顯微結(jié)構(gòu)的研究顯示，透骨消痛膠囊干預(yù)OP性O(shè)A具有較好療效[12]。本研究擬進(jìn)一步分析透骨消痛膠囊干預(yù)OP性O(shè)A動(dòng)物模型對(duì)骨代謝水平和炎癥因子水平變化的作用，為進(jìn)一步探索該藥用于OP性O(shè)A治療提供實(shí)驗(yàn)和理論根據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物 6月齡雌性新西蘭大白兔48只，體質(zhì)量1.8～2.1 kg，動(dòng)物來(lái)源于上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)CXK-（滬）2012-0011；實(shí)驗(yàn)在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（閩）2009-0001，分籠飼養(yǎng)，食用標(biāo)準(zhǔn)兔顆粒飼料。透骨消痛膠囊為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（閩制字Z20100006）。

1.2 主要儀器和材料 ALP、TRAP檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；ELISA試劑盒（上海西唐生物技術(shù)有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司，Infinite 200 PRO）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型，碧云天生物技術(shù)有限公司）；IL-1β抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）、TNF-α抗體（安迪生物科技有限公司）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司，PowerPac HC）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司，ChemiDocXRS+）。

2 方 法

2.1 模型制備與鑒定 首先進(jìn)行OP性O(shè)A動(dòng)物模型的造模實(shí)驗(yàn)，取12只大白兔分為模型對(duì)照組、正常對(duì)照組，每組6只。模型對(duì)照組麻醉，手術(shù)切除雙側(cè)卵巢誘導(dǎo)OP[7]；4周后，右側(cè)膝關(guān)節(jié)手術(shù)誘導(dǎo)OA[13]；1周后，每日強(qiáng)迫活動(dòng)30 min，維持

4周，以建立OP性O(shè)A模型。與正常對(duì)照兔比較，經(jīng)Micro-CT、組織病理鑒定比較，膝關(guān)節(jié)的股骨骨質(zhì)疏松，軟骨損傷為OA中期，提示造模成功[3，12]。

2.2 分組、給藥與取材 取36只大白兔分為模型對(duì)照組、中藥組、正常對(duì)照組，每組12只。模型對(duì)照組與中藥組造模方法同2.1。中藥組用透骨消痛膠囊參照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算以1.86 g·kg-1灌胃[14]；正常對(duì)照組與模型對(duì)照組等量生理鹽水灌胃，每日1次；維持干預(yù)4周、8周時(shí)分別取材，每次每組6只。干預(yù)結(jié)束后，麻醉，腹主動(dòng)脈采血；分離血清；取膝關(guān)節(jié)股骨外髁軟骨與軟骨下骨，置-80 ℃冰箱保存。

2.3 骨重建血清標(biāo)志物檢測(cè)

2.3.1 生化分析骨形成與骨吸收標(biāo)志物ALP、TRAP 將血清樣品用檢測(cè)緩沖液稀釋5倍、10倍；使用ALP、TRAP檢測(cè)試劑盒；配制顯色底物溶液；制備標(biāo)準(zhǔn)品工作液（0.5 mmol·L-1的p-nitrophenol液）；取96孔板按空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔加入檢測(cè)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、血清樣品及顯色底物等試劑；37 ℃反應(yīng)30 min，加終止液；用多功能酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)吸光度值；據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、酶活性定義公式，計(jì)算ALP、TRAP活性。

2.3.2 ELISA測(cè)定骨重建關(guān)鍵因子OPG和RANKLELISA試劑盒配制標(biāo)液，配制標(biāo)準(zhǔn)品液，配制洗滌液；各孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品100 μL，37 ℃反應(yīng)40 min；洗板4次，控干；各孔加入工作液100 μL，37 ℃反應(yīng)20 min；洗板4次，控干；將酶標(biāo)抗體工作液100 μL加入各孔，37 ℃反應(yīng)10 min；洗板4次，控干；將底物工作液100 μL加入各孔，37 ℃暗處反應(yīng)15 min；100 μL終止液加入各孔；用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值；計(jì)算各組OPG、RANKL值。

2.4 股骨炎癥因子Western Blot分析 提取股骨外髁蛋白，用BCA蛋白定量法測(cè)定總蛋白濃度。將蛋白樣本與上樣緩沖液混勻，在SDS-PAGE上樣孔中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜；PVDF膜放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的BSA中封閉3 h，再分別加入抗IL-1β、TNF-α的一抗及相應(yīng)二抗4 ℃孵育過(guò)夜；TBST清洗后加入ECL發(fā)光劑顯影，用蛋白化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像；以β-actin作為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較符合正態(tài)分布采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 影響骨形成與骨吸收的血清ALP、TRAP變化 4周時(shí)，模型對(duì)照組ALP、TRAP活性較正常對(duì)照組顯著升高（P < 0.01）。中藥組干預(yù)4周、8周后較模型對(duì)照組降低（P < 0.01或P < 0.05）；與正常對(duì)照組比較，中藥組干預(yù)4周后ALP活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而8周后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。中藥組干預(yù)4周、8周后，TRAP均較正常對(duì)照組顯著升高（P < 0.01）。

見表1。

3.2 影響骨吸收抑制與促進(jìn)因子的血清OPG、RANKL變化 4周時(shí)，模型對(duì)照組OPG、RANKL含量均較正常對(duì)照組顯著升高（P < 0.01）。中藥組干預(yù)4周、8周后均較模型對(duì)照組降低（P < 0.01）；

與正常對(duì)照組比較，中藥組干預(yù)4周OPG差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），但8周時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。中藥組干預(yù)4周、8周后RANKL差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3.3 影響骨重建平衡的OPG/RANKL比值變化 4周時(shí)，模型對(duì)照組OPG/RANKL比值均較正常對(duì)照組顯著降低（P < 0.01）。中藥組干預(yù)4周、8周后均較模型對(duì)照組顯著升高（P < 0.01）；但與正常對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3.4 影響股骨炎癥因子水平的IL-1β、TNF-α變化 4周時(shí)，模型對(duì)照組IL-1β、TNF-α值較正常對(duì)照組顯著升高（P < 0.01）；中藥組干預(yù)4周后較模型對(duì)照組顯著降低（P < 0.01）。中藥組與正常對(duì)照組比較，IL-1β差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），TNF-α差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖1、表4。

4 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，OA、OP病位均在骨與軟骨[15]，且腎主骨，肝腎兩者聯(lián)系緊密，故OA和OP的內(nèi)因主要為肝腎不足[16]。中藥透骨消痛膠囊能夠補(bǔ)腎柔肝[17-18]，故推測(cè)該藥對(duì)OP性O(shè)A也有一定作用。前期研究表明，透骨消痛膠囊可在一定程度上延緩OP性O(shè)A的病理進(jìn)程[12]。本研究通過(guò)觀察生化指標(biāo)、炎癥因子水平變化對(duì)OP性O(shè)A的影響，進(jìn)一步論證透骨消痛膠囊對(duì)OP性O(shè)A的治療意義。

4.1 透骨消通膠囊通過(guò)降低骨重建速率改善軟骨下骨損傷 骨代謝水平的變化影響著骨的結(jié)構(gòu)與質(zhì)量。ALP能有效反映骨形成，TRAP則能反映骨吸收狀況[19]。4周、8周時(shí)，模型對(duì)照組骨形成與骨吸收指標(biāo)都顯著增加，說(shuō)明此時(shí)骨代謝水平異常提高，骨重建過(guò)度增強(qiáng)，骨量減少[3]；而用中藥治療后，降低了模型對(duì)照組異常升高的ALP、TRAP水平，使骨形成和骨吸收水平均下調(diào)。對(duì)于ALP而言，藥物治療4周時(shí)效果較好，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；而治療8周時(shí)雖能抑制異常增加的骨形成，但不能使ALP恢復(fù)至接近對(duì)照水平。對(duì)于TRAP，藥物雖能抑制異常增加的骨吸收，但未使TRAP恢復(fù)至接近對(duì)照水平。故藥物抑制骨吸收的作用更強(qiáng)，促進(jìn)骨代謝平衡向骨形成方向移動(dòng)，增加骨量[12]，延緩了OP性O(shè)A病理進(jìn)程。這可能與中藥中巴戟天多糖抗骨質(zhì)疏松、川芎嗪改善微循環(huán)作用有關(guān)[20-21]。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是調(diào)控骨重建最重要的信號(hào)通路之一[6]，當(dāng)抑制骨吸收的OPG與促進(jìn)骨吸收的RANKL比值升高時(shí)，骨代謝水平向正平衡移動(dòng)，可誘導(dǎo)骨形成；反之，骨代謝向負(fù)平衡方向移動(dòng)，有助于骨吸收[22]。OP性O(shè)A的軟骨下骨重建異常，模型對(duì)照組OPG和RANKL含量較正常對(duì)照組均顯著增加，進(jìn)而使得骨形成與骨吸收異常增加，骨重建異常增強(qiáng)，且RANKL增加的程度大于OPG，故OPG/RANKL比值顯著降低[3]，這表明骨吸收水平增加，骨代謝處于負(fù)平衡狀態(tài)。但不同于通常OP模型中OPG含量降低、RANKL含量顯著增加導(dǎo)致OPG/RANKL比值顯著降低的情況[23]，而是與OA患者OPG和RANKL含量都增加的情況一致[24]。可推測(cè)OP性O(shè)A模型中，OA可能起主導(dǎo)作用，所以血清OPG和RANKL含量的變化與OA患者一致。

由于透骨消痛膠囊可通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞OPG/RANKL表達(dá)率影響骨重建平衡[25-26]，故治療后，異常升高的OPG和RANKL均不同程度降低，進(jìn)而使得異常增強(qiáng)的骨形成能力、骨吸收能力均下降，骨重建異常狀況改善。OPG在治療8周時(shí)效果較好，而治療4周抑制骨吸收能力雖下降，但不能完全使OPG恢復(fù)至對(duì)照水平；中藥降低異常升高的RANKL，效果較好且接近正常對(duì)照水平。故RANKL降低的程度大于OPG，OPG/RANKL比值顯著增加接近對(duì)照組，這表明骨代謝向正平衡方向移動(dòng)，骨形成增加，可見中藥對(duì)骨代謝平衡有重要調(diào)節(jié)作用。中藥組與正常對(duì)照組比較，藥物干預(yù)8周OPG、RANKL效果更好，但藥物治療4周時(shí)ALP效果較好；這可能因ALP是參與構(gòu)成骨重建，而OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)則是調(diào)節(jié)骨重建[6]，故ALP會(huì)先于OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)出現(xiàn)變化。該實(shí)驗(yàn)提示，適當(dāng)延長(zhǎng)治療時(shí)間對(duì)治療OP性O(shè)A可能有一定意義。

4.2 透骨消通膠囊通過(guò)降低炎癥因子水平改善軟骨損傷 IL-1β和TNF-α可促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌金屬蛋白酶降解軟骨基質(zhì)，還能抑制蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成和分泌，破壞其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使軟骨失去黏彈性和硬度，導(dǎo)致軟骨結(jié)構(gòu)損傷且受到外力時(shí)更容易發(fā)生退變[27]；且兩者具有協(xié)同作用，能夠共同促進(jìn)關(guān)節(jié)組織的破壞[28]，炎癥因子水平越高則軟骨損傷程度越嚴(yán)重。此外，IL-1β和TNF-α還會(huì)下調(diào)OPG/RANKL比值，影響骨重建，使得骨代謝平衡向骨吸收方向移動(dòng)[5]。因此，抑制IL-1β和TNF-α被認(rèn)為是防止軟骨及軟骨下骨破壞的有效方法。

模型對(duì)照組IL-1β和TNF-α顯著升高，表明造模后軟骨損傷嚴(yán)重；而中藥組較模型對(duì)照組兩者均顯著降低，表明中藥可有效降低異常升高的炎癥因子水平，延緩軟骨損傷。這可能與中藥中巴戟天多糖和芍藥苷等成分的苷類部位與生物堿部位發(fā)揮的抗炎作用[18，28-29]有關(guān)，還可能與腫節(jié)風(fēng)、白芍調(diào)節(jié)免疫、抗炎作用[30-31]有關(guān)；且透骨消痛膠囊對(duì)TNF-α損傷的成骨細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，可能具有保護(hù)骨形成免受炎癥的作用[26]，故該藥可能會(huì)從不同途徑減輕IL-1β、TNF-α引起的炎癥反應(yīng)。前期已有多種動(dòng)物OA模型實(shí)驗(yàn)證明，透骨消痛膠囊具有抑制炎癥因子作用[32-33]，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)該藥物也能降低OP性O(shè)A模型動(dòng)物炎癥因子水平。

綜上所述，透骨消痛膠囊能干預(yù)并延緩OP性O(shè)A的病理進(jìn)程，主要通過(guò)兩個(gè)方面起作用。一方面通過(guò)降低異常的骨形成、骨吸收，下調(diào)過(guò)度的骨重建速率[7]，調(diào)節(jié)骨代謝生化水平，促進(jìn)平衡向骨形成方向移動(dòng)，增加骨量，而改善軟骨下骨結(jié)

構(gòu)[12]，更好地支撐軟骨；另一方面通過(guò)下調(diào)炎癥因子水平，促進(jìn)蛋白多糖合成分泌保護(hù)軟骨，而減輕軟骨損傷[12，34]。本文結(jié)合前期研究有利于從微觀到宏觀分析透骨消痛膠囊改善軟骨下骨微細(xì)結(jié)構(gòu)與軟骨顯微結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制[12]，進(jìn)一步提示該藥可在臨床上擴(kuò)展應(yīng)用于治療OP性O(shè)A。

致謝：感謝福建中西醫(yī)結(jié)合研究院骨病研究所劉獻(xiàn)祥教授、吳廣文副研究員、吳銀生副研究員對(duì)本課題的大力支持與協(xié)助！

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收稿日期：2018-09-24；修回日期：2018-11-08