賽甫拉合劑對對乙酰氨基酚致大鼠肝損傷的保護(hù)作用

李夢佳，艾尼瓦爾·塔力甫，程路峰*，阿吉艾克拜爾·艾薩*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，烏魯木齊 830011；2.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所新疆特有藥用資源利用重點實驗室，烏魯木齊 830011)

木尼孜其賽甫拉合劑簡稱賽甫拉(SFL)合劑，是由地棉草、菊苣根、天山堇菜花、菊苣子、睡蓮花、玫瑰花、小紅棗和刺糖制成。對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一種臨床應(yīng)用廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，當(dāng)病人在安全劑量范圍內(nèi)服用時，具有良好的解熱鎮(zhèn)痛效果。研究發(fā)現(xiàn)，長期或過量使用對乙酰氨基酚會導(dǎo)致體內(nèi)生成的毒性代謝產(chǎn)物不能及時排出而誘導(dǎo)肝臟毒性、急性肝損傷甚至是肝功能衰竭[1-4]。對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷是藥物性肝損傷中最常見的。藥物性肝損傷(DILI)臨床上表現(xiàn)為急慢性藥物性肝炎和藥物性肝硬化[5-6]，因其發(fā)生范圍廣，預(yù)測性差，無特異性治療方案，且目前用對乙酰氨基酚誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生的肝損傷與人肝損傷表現(xiàn)相似，所以常用作篩選保肝藥物實驗肝損傷模型的制備[7]，本文利用對乙酰氨基酚肝損傷模型探討SFL合劑對大鼠肝損傷的保護(hù)作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 電子秤(中山市衡新電子有限公司)；AB104N型分析天平(美國梅特勒-托利多公司)；酶標(biāo)分析儀(北京賽爾福知心科技有限公司)。

1.2試藥 SFL合劑由地棉草、菊苣根、天山堇菜花、菊苣子、睡蓮花、玫瑰花、小紅棗和刺糖8味藥材按等質(zhì)量比例混合，加水煎煮3次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，濾液于60 ℃下減壓濃縮至相對密度為1.0～1.20(室溫)的浸膏，出膏率為21.1%，1 g浸膏相當(dāng)于4.728 g生藥，真空干燥，即得SFL合劑。對乙酰氨基酚(原藥，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，上海源葉生物科技有限公司)；Elisa試劑盒：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)和細(xì)胞色素酶(CYP-450)，均購自上海鈺博有限責(zé)任公司；水飛薊賓(規(guī)格：35 mg；批號161264，天津天士力圣特制藥股份有限公司)。

1.3實驗動物 昆明種小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，40只，雌雄各半，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(新)2010-0001，級別：SPF級。SD大鼠，體質(zhì)量為150～200 g，72 只，雄性，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK (新) 2016-0002，級別：SPF級。飼養(yǎng)環(huán)境模擬自然晝夜條件，溫度：22～25 ℃，相對濕度：40%～60%，自由飲水。實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法

2.1SFL合劑的安全性評價 將雌雄各半的40只SPF級昆明種小鼠禁食16 h,隨機(jī)分為對照組和SFL合劑治療組，按公斤體質(zhì)量對照組給予生理鹽水40 mL，SFL合劑(質(zhì)量濃度為1.89 g·mL-1)灌胃給藥。觀察小鼠治療前后的行為、特點，記錄毒性反應(yīng)時間、恢復(fù)時間和死亡率。隨后，記錄小鼠在治療當(dāng)天(第0天)和治療后第4，7，10和14天的體質(zhì)量。

2.2對乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷 將體質(zhì)量為150～220 g的雄性SD大鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對照組和實驗組，對照組灌胃等體積的蒸餾水，實驗組按公斤體質(zhì)量灌胃750 mg對乙酰氨基酚，30 d后，將實驗組隨機(jī)分為對乙酰氨基酚肝損傷模型組(APAP模型組)、水飛薊賓 (21 mg)組、SFL合劑低(150 mg)、中(300 mg)和高(600 mg)劑量組，每組12只，共72只。除對照組與APAP模型組灌胃等體積的蒸餾水外，治療組每日上午給予低、中和高3個劑量(以藥材粉末計算)的SFL合劑，水飛薊賓組給予水飛薊賓膠囊內(nèi)容物，同時每日下午其他各組(除對照組外)給予對乙酰氨基酚400 mg，連續(xù)給予4 周。每周根據(jù)動物體質(zhì)量情況調(diào)整灌胃液體體積。

2.3大鼠血清水平因子的檢測 末次給藥后禁食不禁水16 h(晚18∶00至第2天早10∶00)，取動物血液進(jìn)行相關(guān)測定。以復(fù)合麻醉方法(地西泮、氯胺酮和阿托品各1支，質(zhì)量濃度分別為5,50和0.5 mg·mL-1，用生理鹽水稀釋到10 mL)按100 g 體質(zhì)量0.3～0.5 mL對大鼠腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，在4 ℃以3 000 r·min-1離心10 min，分離血清；血清分裝200 μL，凍于-20 ℃冰箱中待用，按試劑盒方法檢測大鼠ALT、AST、ALP、TNF-α、T-CHO、TG、LDL和HDL水平。

2.4大鼠肝組織勻漿因子檢測 麻醉大鼠，腹主動脈取血，待取血完畢后，按常規(guī)方法解剖，剝離完整的肝臟組織，每只大鼠肝臟于同一位置取組織0.5 g，以 4 ℃ 質(zhì)量濃度為9 mg·mL-1的氯化鈉溶液于冰浴中制成體積分?jǐn)?shù)為10%的肝組織勻漿，在4 ℃ 以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，分裝200 μL,凍于-20 ℃冰箱中待用，按試劑盒方法檢測大鼠組織勻漿中的GSH、MDA、SOD、ROS和CYP-450水平。

2.5肝組織的病理切片觀察 每只大鼠肝右葉距邊緣 0.5 cm 處取 2 cm×4 cm×10 cm 小塊肝臟組織，用 4 ℃ 生理鹽水沖盡殘血，濾紙拭干，用10% 中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅 (HE) 染色，光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1SFL合劑的安全性評價 與對照組比較，SFL合劑組小鼠的生理功能無異常，無毒性反應(yīng)，死亡率發(fā)生在14 d之后的介入治療。相反，在10 d之前，SFL合劑組小鼠比對照組小鼠體質(zhì)量增長明顯緩慢。隨后2組體質(zhì)量變化趨勢比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這可能表明最初出現(xiàn)的差異變化是由于SFL合劑劑量太大限制了小鼠的進(jìn)食，從而導(dǎo)致早期給藥時生長緩慢。10 d后，相比其他2組，SFL合劑組小鼠體質(zhì)量增長，提示SFL合劑不會影響小鼠的生長過程，見圖1。此外，臟器的位置、大小、顏色、黏附力均無明顯變化，臟器表面及臟器切片無黃斑和腫瘤等異常變化。結(jié)果表明，大劑量的SFL合劑對小鼠無急性毒性反應(yīng)，對小鼠生長無任何影響，表明其安全性好。

圖1 SFL合劑對小鼠體質(zhì)量的影響

A.雌性小鼠；B.雄性小鼠。

Fig.1 Effect of SFL Mixture on the mice weight

A.female mice;B.male mice.

3.2SFL合劑對對乙酰氨基酚致肝損傷大鼠血清中AST、ALT、ALP和TNF-α水平的影響 與對照組比較，APAP模型組大鼠血清AST、ALT、ALP和TNF-α炎癥因子水平明顯升高(P<0.05)；與APAP模型組比較，水飛薊賓組與SFL合劑(150，300和600 mg)組大鼠血清AST、ALT、ALP和TNF-α炎癥因子水平明顯降低(P<0.05)，SFL合劑150，300與600 mg組間無明顯差異，而SFL合劑150和300 mg組血清指標(biāo)ALT和ALP水平的改善不如水飛薊賓組(P<0.05)。結(jié)果提示，SFL合劑組可以降低大鼠血清中的生化指標(biāo)和炎癥因子，從而對肝損傷大鼠具有保護(hù)作用。見表1。

3.3SFL合劑對對乙酰氨基酚致大鼠肝損傷肝組織中GSH，MDA，SOD，ROS和CYP-450的影響 與對照組比較，APAP模型組大鼠血清中GSH和SOD水平降低(P<0.01)，肝組織中 MDA和ROS水平明顯增高(P<0.01)，但是對CYP-450活性無明顯改變。與APAP模型組大鼠比較，水飛薊賓組與SFL合劑(150，300和600 mg)組大鼠組織勻漿MDA和ROS水平明顯降低(P<0.01)，GSH和SOD水平升高(P<0.05)，但SFL合劑150 mg組對GSH改善作用無統(tǒng)計學(xué)意義，SFL合劑300和600 mg組與水飛薊賓組對MDA改善水平相當(dāng)，對ROS水平改善不及水飛薊賓組。而SFL合劑組與水飛薊賓組對CYP-450活性無明顯改變。結(jié)果提示，SFL合劑組可降低大鼠組織勻漿的ROS和MDA水平，升高GSH和SOD水平，從而發(fā)揮對肝損傷大鼠的保護(hù)作用。見表2。

表1 SFL合劑對對乙酰氨基酚致大鼠肝損傷血清中AST、ALT、ALP和TNF-α水平的影響

組別劑量/mg·kg-1AST水平/U·L-1ALT水平/U·L-1ALP水平/U·L-1TNF-α水平/pg·mL-1對照組296.18±11.57 67.30±2.9455.82±2.56233.90±6.16APAP模型組361.41±6.87??101.73±1.89??76.52±1.95??301.20±5.77??水飛薊賓組21298.05±11.87##73.22±2.42##57.90±2.53##265.01±7.07##SFL合劑低劑量組150315.57±12.03##93.45±2.60#&&68.11±2.77#&&274.30±9.20#SFL合劑中劑量組300313.85±10.58##82.86±2.22##&&65.36±1.70##&249.80±5.92##SFL合劑高劑量組600307.46±8.91##82.91±2.71##&&59.71±1.78##266.31±6.01##

注：與對照組比較**P<0.01；與模型組比較#P<0.05,##P<0.01；與水飛薊賓組比較&P<0.05，&&P<0.01。

表2 SFL合劑對對乙酰氨基酚致大鼠肝損傷肝組織中GSH，MDA，SOD，ROS水平和CYP-450活性的影響

組別劑量/mg·kg-1GSH水平/mmol·L-1MDA水平/nmol·L-1SOD水平/U·mL-1ROS水平/U·mL-1CYP-450活性/ng·mL-1對照組274.92±11.739.43±0.19200.36±4.44348.30±5.2510.28±0.34APAP模型組226.52±13.23??11.32±0.32??142.52±5.53??480.27±5.06??10.68±0.28水飛薊賓組21273.64±11.47##9.12±0.19##161.05±7.29#350.04±9.97##9.96±0.25SFL合劑低劑量組150249.77±10.1710.17±0.22##&159.65±3.18#420.40±10.00##&&10.26±0.33SFL合劑中劑量組300264.50±4.71#9.52±0.18##161.59±4.49#401.22±10.03##&&10.39±0.30SFL合劑高劑量組600265.87±7.22#9.51±0.14##162.13±4.06##394.55±5.03##&&10.82±0.14

注：與對照組比較**P<0.01；與模型組比較#P<0.05,##P<0.01；與水飛薊賓組比較&P<0.05，&&P<0.01。

3.4SFL合劑對對乙酰氨基酚致大鼠肝損傷血清中T-CHO、TG、HDL和LDL含量的影響 與對照組比較，APAP模型組大鼠血清T-CHO、TG和LDL含量增高(P<0.05)，HDL含量明顯降低(P<0.01)，與APAP模型組大鼠相比，水飛薊賓組與SFL合劑150，300和600 mg組大鼠T-CHO含量明顯減少(P<0.01)，且SFL合劑150，300與600 mg組間無明顯差異。水飛薊賓組能降低T-CHO、TG和LDL含量，升高HDL含量(P<0.05)，而SFL合劑組對其他3個指標(biāo)改善差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示，SFL合劑組對肝損傷大鼠血脂影響并不明顯。見表3。

表3 SFL合劑對對乙酰氨基酚致大鼠肝損傷血清中T-CHO、TG、LDL和HDL含量的影響

組別劑量/mg·kg-1T-CHO/mmol·L-1TG/mmol·L-1LDL/mmol·L-1HDL/mmol·L-1對照組2.14±0.171.04±0.031.51±0.231.22±0.14APAP模型組3.30±0.14??1.15±0.04?2.11±0.21?0.68±0.10??水飛薊賓組212.44±0.22##1.02±0.02#1.26±0.22#1.05±0.14#SFL合劑低劑量組1502.57±0.12##1.04±0.061.55±0.190.71±0.13SFL合劑中劑量組3002.33±0.17##1.13±0.061.81±0.180.89±0.07SFL合劑高劑量組6002.42±0.13##1.10±0.071.70±0.170.88±0.07

注：與對照組比較*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較#P<0.05,##P<0.01。

3.5SFL合劑對對乙酰氨基酚致大鼠肝損傷的肝臟病理組織的影響 對照組肝臟質(zhì)軟富有彈性，表面光滑，呈褐紫色；APAP模型組的肝臟質(zhì)脆體積增大，呈褐紅色，表面略顯粗糙，肉眼可見大多數(shù)存在散在細(xì)小顆粒；SFL合劑低、中、高劑量組和水飛薊賓組肝臟大小、顏色、粗糙程度均界于APAP模型組與對照組之間。光鏡所見：對照組肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉存在，中央靜脈、小血管及肝竇均可見淤血，匯管區(qū)無明顯變化。水飛薊賓組鏡下結(jié)構(gòu)與對照組相似。SFL合劑低、中、高劑量組肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉存在，肝細(xì)胞可見水腫，中央靜脈、小血管及肝竇均可見淤血。APAP模型組肝結(jié)構(gòu)正常，肝小葉存在，肝細(xì)胞水腫，肝竇擴(kuò)張、淤血，中央靜脈、小血管淤血。隨機(jī)選擇每組大鼠的病理切片光鏡下拍照。結(jié)果見圖2。

圖2 各組肝臟病理組織結(jié)果

A.對照組；B.對乙酰氨基酚肝損傷模型組；C.SFL合劑低劑量組；D.SFL合劑中劑量組；E.SFL合劑高劑量組；F.水飛薊賓組。

Fig.2 The results of hepatic pathology in each group

A.control group；B.APAP model group；C.SFL Mixture low dose group；D.SFL Mixture middle dose group；E.SFL Mixture high dose group；F.silibinin group.

4 討論

對乙酰氨基酚目前是一種較好的乙酰苯胺類藥物，臨床上常用它作為非抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥物，通過抑制前列腺素等的合成和釋放，提高痛閾而起到鎮(zhèn)痛作用，屬于外周性鎮(zhèn)痛藥，如感冒引起的發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛及肌肉痛等[8]。安全劑量范圍內(nèi)對人體無害，但過量或長期服用會導(dǎo)致肝臟損傷甚至是急性肝功能衰竭，從而威脅生命。在體內(nèi)，肝臟是對乙酰氨基酚代謝的主要場所。通常情況下，安全劑量的對乙酰氨基酚到達(dá)體內(nèi)后，95%在經(jīng)過肝臟代謝后，以原形或經(jīng)磺基轉(zhuǎn)移酶及葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的催化作用與硫酸、葡萄糖醛酸或半胱氨酸相結(jié)合形成無毒性的產(chǎn)物從腎臟排出體外。當(dāng)過量的對乙酰苯醌亞胺(N-acetyl-p-benzoquinonimine，NAPQI)被吸收入肝后，對乙酰氨基酚與硫酸、葡萄糖醛酸相結(jié)合的代謝通路達(dá)到飽和后，剩余未被代謝的對乙酰氨基酚則會通過肝細(xì)胞的細(xì)胞色素 P450 酶的代謝，生成具有毒性的NAPQI，可通過與肝內(nèi)的還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)結(jié)合而快速地被代謝清除[9-10]。當(dāng)肝臟內(nèi)儲備的 GSH 被過量的 NAPQI 耗竭后，剩余的 NAPQI 則會與細(xì)胞相關(guān)蛋白結(jié)合，生成大量的 NAPQI-蛋白復(fù)合物，從而引發(fā)對乙酰氨基酚導(dǎo)致肝損傷后一系列的相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)[11-12]。

SFL合劑是一種中藥復(fù)方，劉燕等[13]報道了地棉草、菊苣根、菊苣子、睡蓮花和小紅棗具有清肝利膽、健胃消食和利膽消腫之功效，臨床主治肝炎和膽囊炎等肝膽疾?。惶焐捷啦藶檩啦丝戚啦藢傩陆胤N藥用植物，以全草入藥，具有清熱解毒功效[14-15]；小枝玫瑰花為薔薇科植物玫瑰花的干燥花蕾，味甘、微苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)[16-17]；刺糖是豆科駱駝刺屬植物駱駝刺的分泌糖粒，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、平衡體液、潤腸通便和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功效[18-19]。本研究8味藥材組成的SFL合劑能產(chǎn)生更好的保肝作用。

本研究從安全性實驗的評價出發(fā)，按公斤體質(zhì)量小鼠灌胃給予40 mL SFL合劑后，發(fā)現(xiàn)對正常小鼠無任何毒性，不影響小鼠的生長，提示40 mL臨床劑量下給藥SFL合劑是安全的，且在治療肝損傷過程中不會對小鼠產(chǎn)生任何不良反應(yīng)。與以往報道的研究結(jié)果相一致[20]，本研究中大劑量的對乙酰氨基酚可使肝損傷大鼠血清中 ALT、AST、ALP和TNF-α水平明顯升高，而肝組織勻漿中ROS和MDA水平均明顯增高，GSH和SOD水平明顯降低，病理切片觀察到肝組織中存在淤血、肝細(xì)胞水腫，提示成功制備了對乙酰氨基酚致肝損傷模型。SFL合劑灌胃給予大鼠，檢測大鼠血清發(fā)現(xiàn)AST、ALT、ALP和TNF-α水平明顯下降，效果雖不及水飛薊賓的改善效果，但表明SFL合劑也可減輕對乙酰氨基酚引起的肝毒性。此外，SFL合劑治療后，肝勻漿中ROS和MDA水平也明顯降低，說明SFL合劑參與治療肝損傷大鼠療效顯著。

綜上所述，本研究通過血清、組織生化各指標(biāo)檢測以及病理切片表明SFL合劑可有效抑制肝損傷大鼠的血清、肝組織勻漿生化指標(biāo)與炎癥因子。結(jié)合對肝損傷預(yù)防作用以及產(chǎn)生相對較低的不良作用，可將SFL合劑作為一種潛在的保肝藥物。SFL合劑發(fā)揮強(qiáng)效的保肝作用，需要進(jìn)一步對SFL合劑的主要成分配比進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整、優(yōu)化并驗證。