UPLC法同時(shí)測定丹參片中6種酚酸類成分的含量

秦學(xué)玲，楊璐璐，馬 娜，蔣新平，秦興衛(wèi)

(1.云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，昆明 650011；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二○醫(yī)院，昆明 650032；3.云南百康藥業(yè)有限公司，昆明 650106；4.昆明賽諾制藥股份有限公司，昆明 650011)

丹參片具有活血化瘀的作用[1]，臨床主治各種心血管系統(tǒng)疾病[2-5]。軍事訓(xùn)練中急性損傷后期或軟組織慢性損傷，有瘀斑或瘀血并伴腫痛者，口服丹參片有活血化瘀及緩解腫痛的作用。研究表明，酚酸類成分是丹參片中的主要有效成分[6]，其中丹酚酸A和丹酚酸B的活性最強(qiáng)。丹參片在《中國藥典》2015年版一部中的含量測定項(xiàng)為HPLC法測定丹參中丹酚酸B的含量[1]，因此，酚酸類成分是控制丹參片質(zhì)量的重要指標(biāo)成分。

丹參及丹參片中的丹參酮類成分和酚酸類成分的含量測定方法已有報(bào)道[6-19]，一般采用HPLC法或高效毛細(xì)管電泳法對丹參片中原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、原兒茶酸乙酯、丹酚酸B和丹酚酸A進(jìn)行測定。李耿等[20]采用UPLC法在檢測波長分別為265和280 nm處同時(shí)測定丹參藥材中多種成分的含量。本實(shí)驗(yàn)以探究丹參片質(zhì)量控制為關(guān)鍵，以多指標(biāo)綜合評價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量為出發(fā)點(diǎn)，將快速、簡便、高效、靈敏的方法運(yùn)用到產(chǎn)品的質(zhì)量控制中。運(yùn)用UPLC法對本次國家評價(jià)性抽驗(yàn)的8個(gè)不同廠家74批次丹參片樣品，在檢測波長為280 nm處對6種酚酸類成分(丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A)的含量進(jìn)行測定，在16 min內(nèi)能同時(shí)快速、準(zhǔn)確地測定丹參片中6種酚酸類成分的含量。通過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法操作簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可快速、有效地控制丹參片的質(zhì)量，節(jié)約分析時(shí)間，為丹參片的質(zhì)量監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 超高效液相色譜(UPLC)Agilent Technologies 1290 lnfinity系統(tǒng)(美國安捷倫公司)； 色譜柱：Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美國Waters公司)；Mettler AE240電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 丹參素鈉(批號110855-201311)、迷迭香酸(批號111871-201102)、丹酚酸B(批號111562-201514)和原兒茶醛對照品(批號110810-200506)，均購自中國食品藥品檢定研究院；丹酚酸A(批號96574-01-5)和紫草酸對照品(批號28831-65-4)，均購自西亞公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；乙腈為色譜純(美國Merck公司)；水為自制高純水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；丹參片為2015年國家評價(jià)性抽驗(yàn)抽取的樣品(批號150305，寧夏啟元國藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.812 5，0.083 2，0.351 6，0.341 2，0.503 4和0.501 5 mg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備 取丹參片樣品適量，糖衣片除去糖衣，研細(xì)，精密稱取0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率280 W，頻率40 kHz)，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.2 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3陰性樣品溶液的制備 取缺丹參的陰性樣品，按照2.2項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液，即得。

2.4色譜條件 采用Waters BEH C18(100 mm×2．1 mm，1．7 μm)色譜柱。以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～14 min，6%B→23%B；14～20 min，23%B→39%B)。柱溫：25 ℃；樣品管理器溫度：4 ℃；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：280 nm。色譜圖見圖1。

2.5線性關(guān)系考察 取2.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，分別進(jìn)樣0.25，0.50，1.00,2.00，5.00,8.00和10.00 μL，以峰面積(y)對進(jìn)樣量(x)進(jìn)行線性回歸，求得工作曲線，得到丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的回歸方程分別為：y1=2 234.1x1-11.936(r1=1.000 0)；y2=10 776x2+0.947 7(r2=0.999 9)；y3=1 195.5x3-7.789 2(r3=1.000 0)；y4=1 516.8x4-7.963 7(r4=0.999 9)；y5=1 913.3x5+6.303 4(r5=1.000 0)；y6=3 712.4x6+38.304(r6=0.999 9)。線性范圍分別為0.203 1～8.125 0，0.020 8～0.832 0，0.087 9～3.516 0，0.085 3～3.412 0，0.125 8～5.034 0和0.125 4～5.015 0 μg。

圖1 HPLC圖

A.混合對照品；B.丹參片樣品；C.陰性樣品；1.丹參素鈉；2.原兒茶醛；3.迷迭香酸；4.紫草酸；5.丹酚酸B；6.丹酚酸A。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.Danshen Tablets sample；C.negative sample；1.tanshinol；2.protocatechuic aldehyde；3.rosmarinci acid；4.lithospermic acid；5.salvianolic acid B；6.salvianolic acid A.

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 取2.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次2 μL，測定峰面積值，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A峰面積的RSD值分別為0.73%，0.71%，0.41%，0.68%，0.16%和0.96%。結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液，于0，2，4，8，12和24 h分別進(jìn)樣2 μL測定，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A峰面積的RSD值分別為0.03%，0.23%，0.10%，0.68%，0.11%和0.07%。表明供試品溶液中的6種待測成分在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取丹參片樣品(批號150305)，按照2.2項(xiàng)下方法平行制得6份供試品溶液，按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣2 μL測定并計(jì)算，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的平均含量分別為7.009，0.799，3.275，3.048，35.480和4.438 mg·g-1，RSD值分別為0.01%，0.09%，0.05%，0.09%，0.01%和0.02%。表明其重復(fù)性良好。

2.9回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取丹參片樣品(批號150305)，6份，每份0.1 g，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A質(zhì)量濃度分別為71.21，8.12，32.81，30.59，354.03和44.52 μg·mL-1的對照品溶液10 mL，再加入體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇溶液50 mL，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣2 μL，測定。結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的平均回收率(n=6)分別為99.2%，99.6%，99.5%，98.7%，99.3%和98.9%，RSD值分別為0.49%，0.79%，0.48%，0.92%，0.40%和0.88%。表明該方法回收率良好。

2.10樣品的測定 取8個(gè)廠家74批次丹參片樣品，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.4項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣2 μL測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表1。

表1 74批次丹參片中6種酚酸類成分的含量測定結(jié)果

Tab.1 The results of content determination of 6 phenolic acids in 74 batches Danshen Tablets

樣品編號含量/mg·片-1丹參素鈉原兒茶醛迷迭香酸紫草酸丹酚酸B丹酚酸A總含量SCG201500031.040.130.760.8713.220.9416.96SCG201500191.820.160.801.1012.251.3917.52SCG201500201.770.140.720.8610.101.3514.94SCG201500461.660.190.871.1012.311.4517.58SCG201500861.470.130.880.9812.711.3117.48SCG201500961.690.170.821.1113.061.5018.35SCG201501051.660.180.921.0813.881.5619.28SCG201501462.290.250.810.869.951.8816.04SCG201501471.740.210.871.1512.701.6418.31SCG201501481.470.150.880.9010.651.0615.11SCG201501631.400.130.981.1314.311.3119.26SCG201502061.720.140.871.2113.441.5418.92SCG201502071.440.140.881.0212.461.0917.03SCG201502081.730.170.811.1612.731.4418.04SCG201502091.480.150.870.9612.441.1417.04SCG201502101.740.180.860.9811.531.3416.63SCG201502111.800.160.791.1412.451.5117.85SCG201502481.540.160.881.1213.941.4019.04SCG201502491.780.150.751.0612.121.5817.44SCG201502501.740.160.781.0212.381.5317.61SCG201502921.820.180.841.0812.391.4517.76SCG201502981.520.140.871.1013.561.5018.69SCG201502991.520.150.861.0813.651.2718.53SCG201503571.670.130.690.809.401.1113.80SCG201503731.730.180.851.0011.671.2716.70SCG201504111.860.160.890.749.410.9814.04SCG201504501.520.160.981.0712.161.1717.06SCG201504511.690.150.871.1112.431.1517.40SCG201504851.790.170.831.1312.491.3317.74SCG201504861.670.160.801.0411.801.2316.70SCG201504901.870.271.361.2414.991.1820.91SCG201501450.840.040.870.9911.620.6715.03SCG201501490.770.030.891.2115.190.7518.84SCG201501500.810.030.851.1014.450.7317.97SCG201501510.900.070.851.0111.760.6915.28SCG201502470.790.030.811.0814.140.6917.54

表1(續(xù)) 74批次丹參片中6種酚酸類成分的含量測定結(jié)果

Tab.1 (Continued) The results of content determination of 6 phenolic acids in 74 batches Danshen Tablets (mg·片-1)

樣品編號含量/mg·片-1丹參素鈉原兒茶醛迷迭香酸紫草酸丹酚酸B丹酚酸A總含量SCG201503030.850.020.601.0013.050.6916.21SCG201503500.810.040.871.0914.370.7317.91SCG201503510.790.040.871.0411.920.6815.34SCG201503520.780.020.820.9913.080.5416.23SCG201503530.810.040.881.0511.960.6715.41SCG201503930.800.020.911.2015.220.7118.86SCG201504830.640.031.281.3714.750.6318.70SCG201504840.660.031.301.3614.750.6118.71SCG201500040.190.020.860.868.560.1410.13SCG201500400.250.050.750.7511.490.2413.34SCG201500830.200.010.870.878.920.1510.54SCG201505040.170.040.910.9112.090.1813.86SCG201503720.180.021.081.0811.340.1413.16SCG201503890.180.031.041.0411.330.1413.13SCG201504000.240.061.081.087.300.109.00SCG201504910.180.041.051.0511.400.1413.21SCG201502930.190.050.940.9411.960.1913.78SCG201500850.280.010.490.357.420.188.72SCG201503010.310.020.510.346.930.228.31SCG201503150.390.010.790.4710.430.2412.32SCG201503160.270.050.470.305.940.217.19SCG201504250.390.030.490.6013.890.2915.69SCG201500841.600.151.061.1814.690.5319.21SCG201502562.320.191.030.9012.411.1017.93SCG201503281.520.141.001.0914.610.5518.91SCG201504092.080.151.011.0214.171.1119.56SCG201500090.400.020.730.6013.030.3015.08SCG201502220.240.010.740.4512.400.2214.06SCG201503440.280.010.780.4612.300.2314.06SCG201503040.330.010.980.8214.290.3216.75SCG201504101.660.171.191.1217.351.0922.58SCG201504650.430.011.040.8014.310.3216.91SCG201504741.770.181.201.1317.241.0422.56SCG201500450.310.010.910.7714.550.3416.89SCG201500510.200.010.910.6814.050.3316.18SCG201502650.260.010.770.5114.710.3116.57SCG201502700.220.010.790.5314.470.2816.30SCG201503002.710.291.241.2515.592.3523.43

3 討論

3.1提取溶劑的選擇 分別以甲醇、體積分?jǐn)?shù)分別為50%，70%，75%和90%的甲醇超聲提取30 min。結(jié)果體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇提取率最高，故選擇體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇作為提取溶劑。

3.2提取方法的選擇 以體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇為提取溶劑，分別超聲15，30和60 min及加熱回流0.5，1.0和2.0 h。結(jié)果表明，超聲提取與加熱回流提取效果相當(dāng)，超聲30與60 min效果相當(dāng)，故提取方法確定為超聲提取30 min。

3.3流動(dòng)相種類的選擇 分別考察了甲醇-1 mL·L-1甲酸、甲醇-1 mL·L-1磷酸和乙腈-1 mL·L-1甲酸、乙腈-1 mL·L-1磷酸4種流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用乙腈-1 mL·L-1磷酸作為流動(dòng)相效果最佳。

3.4檢測波長的選擇 采用UPLC-DAD檢測器，設(shè)定波長范圍200～400 nm對樣品進(jìn)行掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)λ=280 nm時(shí)樣品的吸收峰最多，峰形最好，因此選用λ=280 nm作為6個(gè)成分含量測定的檢測波長。

4 小結(jié)

現(xiàn)行中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項(xiàng)存在只測定某一成分的含量，影響了中藥質(zhì)量評價(jià)的整體性和合理性。本文對丹參片中6個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行含量測定，可以從整體上反映丹參片的質(zhì)量，節(jié)約提取溶劑并縮短分析時(shí)間。