新疆不同產(chǎn)地石榴花中總鞣質(zhì)、沒食子酸和鞣花酸的含量測定

李建梅，李 穎，希爾艾力·吐爾遜*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所維吾爾醫(yī)方劑學重點實驗室，烏魯木齊 830049；2.中國科學院大學，北京 100039)

石榴花為石榴科植物石榴PinicagranatumL.的干燥花瓣，含有多酚類、黃酮類和三萜類等多種成分[1]，在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》(維吾爾藥分冊)中有記載[2]，具有止瀉收斂和止血止汗等功效，主治腹瀉日久，外用治療出血不止、口舌生瘡、脫肛痔瘡、口臭牙痛和皮膚瘙癢等，還可用于治療中耳炎和糖尿病等[3]。

我國新疆和田、喀什和阿圖什等地石榴品質(zhì)較好，是新疆特產(chǎn)[4]。石榴花資源豐富，含有豐富的活性物質(zhì)，具有很高的保健及藥用價值。文獻報道，石榴整株植物活性物質(zhì)的研究和開發(fā)多集中于石榴籽、葉和果皮，相對而言石榴花的研究內(nèi)容較少，主要集中在黃酮類或多酚類物質(zhì)的研究[5-10]，其資源開發(fā)也受到局限。本文采用紫外-可見分光光度法和HPLC法，首次測定了9個新疆不同產(chǎn)地的石榴花藥材中的總鞣質(zhì)、沒食子酸和鞣花酸的含量，對其質(zhì)量控制提供了數(shù)據(jù)支持，以期為開發(fā)利用石榴花資源提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2489紫外檢測器(美國沃特斯公司)；Cintra 20紫外-可見分光光度計(澳大利亞GBC科學儀器公司)；SECURA124-1CN電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；RUPT-10-W超純水機(滕州新瑞分析儀器有限公司)；DFT-200手提式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；PTHW調(diào)溫電熱套(鞏義市予華儀器有限責任公司)；SK8210HP超聲波清洗儀(上?？茖С晝x器有限公司)。

1.2試藥 沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號110831-200302)；鞣花酸對照品(北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司提供，供含量測定用，批號476-66-4)；甲醇、乙腈均為色譜純[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]；水為超純水；磷酸、乙酸均為分析純[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；磷鉬鎢酸、碳酸鈉和干酪素，均為分析純(天津市大茂化學試劑廠)；藥材分別來自新疆和田皮山縣、和田縣、和田于田縣、喀什葉城縣、喀什疏附縣和阿圖什市等9個產(chǎn)地當年產(chǎn)的石榴花，并經(jīng)希爾艾力·吐爾遜主任藥師鑒定為石榴科植物石榴PinicagranatumL.的干燥花瓣。

2 方法與結(jié)果

2.1總鞣質(zhì)的測定

2.1.1對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品12.6 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加水定容至刻度，使完全溶解，精密量取5.0 mL，置于50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.050 4 mg·mL-1的沒食子酸對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱取石榴花藥材粉末(過60目篩)0.4 g，置于250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，室溫下放置24 h，超聲處理10 min，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻后濾過，棄初濾液，精密量取續(xù)濾液20 mL，置于100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得[11-15]。

2.1.3檢測波長的確定 取2.1.1項下制備的對照品溶液和2.1.2項下制備的供試品溶液各2.0 mL，分別置于25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1.0 mL，再加水10 mL，以質(zhì)量濃度為290 g·L-1的碳酸鈉溶液定容，搖勻，室溫下放置30 min，同法制備空白對照溶液，全波長掃描400～900 nm。結(jié)果對照品溶液和供試品溶液均在760 nm波長處有最大吸收，因此選擇樣品的檢測波長為760 nm。

2.1.4樣品的測定 總酚的檢測：精密吸取2.1.2項下制備的供試品溶液2.0 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1.0 mL，搖勻，再加水10 mL，搖勻，用質(zhì)量濃度為290 g·L-1的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，室溫下放置30 min，同時設置空白對照溶液，測定各溶液吸光度值并計算含量。

未被吸附多酚的檢測：稱取0.6 g干酪素，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入2.1.2項下制備的供試品溶液25 mL，密塞，30 ℃水浴中保溫1 h，期間時時振搖，取出放冷至室溫，搖勻，濾過，棄初濾液，精密量取續(xù)濾液2.0 mL，按照總酚檢測方法中自“加入磷鉬鎢酸試液1.0 mL”起，制備樣品，依法測定吸光度值，計算總鞣質(zhì)含量，公式：總鞣質(zhì)含量=總酚含量-未被吸附的多酚含量。

2.1.5方法學考察

2.1.5.1線性關(guān)系考察 精密量取2.1.1項下制備的對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，分別置于6個25 mL棕色量瓶中，先分別加入磷鉬鎢酸試液1.0 mL，再加水定容至13 mL，以質(zhì)量濃度為290 g·L-1體積分數(shù)為29%的碳酸鈉溶液定容，搖勻，室溫下放置30 min，同時設置空白對照溶液，依法測定吸光度值A。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、吸光度值A為縱坐標(y)，繪制標準曲線，計算回歸方程為y1=0.100 2x1-0.003 3，r1=0.999 6(n=6)。說明沒食子酸質(zhì)量濃度在1.000 8～10.080 0 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度值的線性關(guān)系良好。

2.1.5.2精密度實驗 精密吸取2.1.2項下制備的供試品溶液2.0 mL，按照2.1.4項下方法測定供試品溶液的吸光度值，連續(xù)測定6次。結(jié)果6次吸光度RSD值為0.77%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.1.5.3重復性實驗 精密稱取同一批石榴花藥材粉末6份，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1.4項下方法檢測總酚與未被吸附的多酚，計算樣品中總鞣質(zhì)的含量。結(jié)果6份樣品的平均總鞣質(zhì)含量為49.67 mg·g-1，RSD值為2.43%(n=6)，說明該檢測方法重復性良好。

2.1.5.4穩(wěn)定性實驗 取2.1.2項下制備的供試品溶液，在顯色后的0，15，30，40，50和60 min測定吸光度值A。結(jié)果溶液在1 h內(nèi)吸光度RSD值為2.86%(n=6)，表明供試品溶液在配制后1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5.5加樣回收實驗 精密稱取石榴花藥材粉末0.4 g，置于250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，室溫下放置24 h后，超聲處理10 min，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻后濾過，棄初濾液，精密量取續(xù)濾液5.0 mL，6份，分別置于50 mL棕色量瓶中，精密加入2.1.1項下制備的沒食子酸對照品溶液8.0 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。按照2.1.4項下樣品檢測方法測定吸光度值，計算總鞣質(zhì)含量及回收率。結(jié)果6份樣品的平均回收率為99.10%，RSD值為2.00%。

2.2沒食子酸和鞣花酸的含量測定

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸與鞣花酸對照品適量，分別置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為0.452和0.242 mg·mL-1的沒食子酸對照品儲備液和鞣花酸對照品儲備液。精密吸取上述沒食子酸對照品儲備液2.0和5.0 mL，加甲醇分別定容至25 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.036 16和0.090 4 mg·mL-1的沒食子酸對照品溶液；精密吸取鞣花酸對照品儲備液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.024 2 mg·mL-1的鞣花酸對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 沒食子酸測定樣品的制備：精密稱取石榴花藥材粉末0.3 g，加水40 mL，回流提取45 min，定容至50 mL量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得[16-17]。

鞣花酸測定樣品的制備：精密稱取石榴花藥材粉末0.1 g，加甲醇40 mL，回流提取15 min，定容至50 mL量瓶中，用0.45 um微孔濾膜過濾，即得[18-19]。

2.3色譜條件 色譜柱：Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；沒食子酸測定流動相：乙腈-2 mL·L-1甲酸水溶液(1∶99)；鞣花酸測定流動相：乙腈-2 mL·L-1甲酸水溶液(24∶76)；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃[15-20]。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 圖

A.沒食子酸對照品；B.沒食子酸樣品；C.鞣花酸對照品；D.鞣花酸樣品；1.沒食子酸；2.鞣花酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance of gallic acid；B.sample of gallic acid；C.reference substance of ellagic acid；D.sample of ellagic acid；1.gallic acid；2.ellagic acid.

2.4標準曲線的繪制與線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項下制備的沒食子酸對照品溶液2.0，5.0，8.0，11.0和14.0 μL，鞣花酸對照品溶液1.0，3.0，5.0，7.0和9.0 μL，分別按照2.3項下色譜條件進樣分析，以對照品峰面積為縱坐標(y)、進樣量為橫坐標(x)進行線性回歸，得沒食子酸和鞣花酸的回歸方程分別為：y2=3 886 311.63x2-2 516.44(r2=0.999 9)和y3=10 545 570.25x3-46 224.00，(r3=0.999 9)。結(jié)果表明，沒食子酸與鞣花酸含量分別在0.072 32～0.506 20和0.024 20～0.217 80 μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5精密度實驗 精密吸取2.2.1項下制備的沒食子酸和鞣花酸對照品溶液，按照2.3項下色譜條件注入液相色譜儀，重復進樣6次，記錄各自峰面積，沒食子酸峰面積的RSD值為0.58%，鞣花酸峰面積的RSD值為0.53%。

2.6重復性實驗 精密稱取石榴花藥材粉末(和田皮山縣)，按照2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.3項下色譜條件分別測定沒食子酸和鞣花酸的含量，結(jié)果6份樣品中沒食子酸和鞣花酸的平均含量分別為2.51和3.37 mg·g-1，RSD值分別為2.06%和1.79%(n=6)。

2.7穩(wěn)定性實驗 精密稱取石榴花藥材細粉(和田皮山縣)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別在相應色譜條件下于0，2，4，6，8，12和24 h進樣10 μL，測定沒食子酸和鞣花酸峰面積RSD值分別為1.02%和1.87%(n=6)。

2.8回收率測定 結(jié)果見表1。

2.8.1沒食子酸 精密稱取石榴花(和田皮山縣)藥材細粉6份，每份0.25 g，加入2.2.1項下制備的質(zhì)量濃度為0.090 4 mg·mL-1的沒食子酸對照品溶液3.5 mL，置于圓底燒瓶中，加15 mL水回流提取45 min，放冷至室溫，定容至25 mL量瓶中，平行制備6份供試品溶液，按照2.3項下色譜條件進樣測定，結(jié)果沒食子酸的平均回收率為100.92%，RSD值為1.85%。

2.8.2鞣花酸 精密稱取石榴花(和田皮山縣)藥材細粉6份，每份0.06 g，加入質(zhì)量濃度為0.242 mg·mL-1的鞣花酸對照品儲備液0.8 mL，置于圓底燒瓶中，加入40 mL甲醇回流提取15 min，放冷至室溫，定容至50 mL，平行制備6份供試品溶液，按照2.3項下色譜條件進樣測定，鞣花酸的平均回收率為101.30%，RSD值為1.78%。

表1 回收率測定結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test (n=6)

成分樣品量/μg加入量/μg測得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%沒食子酸641.56316.40970.67101.98100.921.85638.04316.40980.82104.13628.00316.40938.1899.01634.78316.40953.21100.32647.83316.40961.8299.63650.59316.40969.73100.42鞣花酸176.93193.60368.9799.12101.301.78173.22193.60369.28101.42186.36193.60386.47103.49173.89193.60373.31103.35191.75193.60386.37100.53182.32193.60375.7199.89

2.9樣品的含量測定 按照2.2.2項下方法分別制備沒食子酸和鞣花酸含量測定用供試品溶液，分別測定總鞣質(zhì)、沒食子酸和鞣花酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地石榴花含量測定結(jié)果

Tab.2 Determination of the contents of pomegranate flowers from different areas

產(chǎn)地總鞣質(zhì)含量/mg·g-1沒食子酸含量/mg·g-1鞣花酸含量/mg·g-1庫車縣62.792.395.34和田于田縣85.622.633.09喀什葉城縣58.373.812.37和田洛浦縣45.452.633.29和田皮山縣113.983.185.22和田墨玉縣42.622.554.45和田縣38.442.513.23喀什疏附縣60.433.413.04阿圖什市60.983.634.32

3 討論

石榴花藥材收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準(維吾爾藥分冊)》1999年版中，原標準僅有藥材的顯微鑒別項，未對其含量進行說明。本研究通過收集新疆不同產(chǎn)地的石榴花，檢測其總鞣質(zhì)、沒食子酸和鞣花酸的含量，為新疆石榴花的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

本研究采用梯度洗脫同時測定沒食子酸與鞣花酸的含量，但由于石榴花中沒食子酸與鞣花酸含量差異較大，同時檢測峰面積差異較大，為了盡可能減小2種成分相互間含量的誤差，且2種成分的樣品制備條件亦不同，故選擇以不同色譜條件、分別制備樣品進行檢測。所得各峰的分離度與拖尾因子均符合《中國藥典》2015年版要求，峰形更好、干擾較小。該方法靈敏度高、分離度好、測定迅速、結(jié)果準確，為石榴花的質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)。

本研究對新疆維吾爾自治區(qū)內(nèi)不同產(chǎn)地石榴花進行檢測發(fā)現(xiàn)，石榴花中總鞣質(zhì)、沒食子酸和鞣花酸的含量各有差異，和田皮山縣石榴花的3種成分含量均顯著高于其他產(chǎn)區(qū)石榴花，這一研究結(jié)果可能與新疆皮山縣的 “皮亞曼石榴”的久負盛名有關(guān)。同時對于開發(fā)利用石榴花提供了一定的參考依據(jù)。若利用這部分資源開發(fā)新制劑，可增加石榴的附加值，提高經(jīng)濟效益。