大鼠肺部侵襲性光滑假絲酵母菌感染過程中Dectin-1蛋白和IL-17、IL-23的含量變化及意義

黃 婷，駱雪萍，趙 瑩，吳呈霖

(1. 桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣西 桂林 541001； 2. 十堰市太和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 十堰 442000)

侵襲性念珠菌病(incasive candidiasis，IC)是指真菌侵入人體內(nèi)臟、血液或表皮角質(zhì)層以下深部組織結(jié)構(gòu)引起的感染。過去IC最常見的病原體是白假絲酵母菌，近年來隨著重癥監(jiān)護(hù)病房中高齡、免疫缺陷或免疫功能低下患者的增多，以及機(jī)械通氣、動(dòng)靜脈穿刺、持續(xù)床旁血液透析、體外膜肺氧合等各種侵入性操作的增加，我國光滑假絲酵母菌血癥已僅次于白假絲酵母菌，在全部假絲酵母菌感染中上升至第4位[1]。光滑假絲酵母菌對氟康唑敏感性低，對一線治療藥物棘白菌素的耐藥率也在逐年增加，從而導(dǎo)致光滑假絲酵母菌感染發(fā)病率高，預(yù)后差，病死率高[2]。

β-葡聚糖是真菌致病的重要成分，樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1(Dectin-1)受體在抗真菌感染免疫以及 β- 葡聚糖介導(dǎo)的機(jī)體固有免疫調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。白細(xì)胞介素(IL)-17是新近發(fā)現(xiàn)的TH17細(xì)胞所分泌的效應(yīng)因子，具有強(qiáng)大的促炎作用。IL-23 是維持 TH17 細(xì)胞亞群分化和穩(wěn)定的重要因子，對IL-17的生成至關(guān)重要，同時(shí)本身也是一種促炎癥因子。研究[3]證實(shí)，白假絲酵母菌感染時(shí)宿主通過免疫系統(tǒng)激活TH17細(xì)胞，產(chǎn)生IL-17、IL-22 等細(xì)胞因子，募集中性粒細(xì)胞殺滅真菌孢子。以往對光滑假絲酵母菌及其β-葡聚糖信號通路、下游相關(guān)細(xì)胞因子的研究相對較少，本研究采用經(jīng)氣管內(nèi)灌注光滑假絲酵母菌菌液復(fù)制光滑假絲酵母菌肺部感染的動(dòng)物模型，通過觀察大鼠肺組織病理改變，肺組織中Dectin-1蛋白表達(dá)量的變化，血清及肺泡灌洗液中IL-17及IL-23含量的動(dòng)態(tài)變化，從而進(jìn)一步探討Dectin-1通路對侵襲性肺部熱處理光滑假絲酵母菌感染的識(shí)別，以及IL-17、IL-23表達(dá)和變化的意義，為光滑假絲酵母菌感染的發(fā)病機(jī)制、治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級雌性SD大鼠54只，體重180～220 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號 SCXK桂2013-0001，按清潔級標(biāo)準(zhǔn)正常飼養(yǎng)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 光滑假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株(編號為9627)購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，PVDF膜購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗鼠 Dectin-1一抗購自美國ABCAM公司，山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，β-actin一抗、二抗及ELC發(fā)光液均購自武漢Proteintech公司，IL-17及IL-23酶聯(lián)接免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自美國eBioscience公司。

1.1.3 熱處理光滑假絲酵母菌懸液的制備 將光滑假絲酵母菌菌株接種于沙堡瓊脂培養(yǎng)基，置于真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，用細(xì)菌接種環(huán)挑取菌落，用滅菌生理鹽水沖洗2次后再用生理鹽水稀釋成菌懸液，采取比濁法將其含菌量定量至5×107CFU/mL，按照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行熱處理(95℃水浴熱處理30 min)，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型制備 健康雌性 SD 大鼠 54 只，所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組(A 組)、直接感染組(B 組)和免疫抑制感染組(C組)，每組 18 只。A組全程正常飼養(yǎng)，C組大鼠連續(xù)5 d腹腔注射地塞米松(0.6 mg/kg)，B組腹腔注射等劑量生理鹽水。5 d后B組及C組大鼠予10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠板，用小型壓舌板將舌體推開，在透射光源下觀察到大鼠會(huì)厭和聲帶的運(yùn)動(dòng)后，以16 G靜脈留置針作為氣管導(dǎo)管在明視下進(jìn)行氣管插管，B組及C組大鼠在氣管插管后一次性快速灌注制備好的熱處理菌懸液0.3 mL，連續(xù)感染3 d，灌注后立即豎立鼠板，水平搖晃3 min使菌液在雙肺內(nèi)均勻分布。

1.2.2 大鼠處死以及血清、肺泡灌洗液的收集 三組大鼠分別于第3次感染后第1、3、5 天，每組隨機(jī)選取6只大鼠，麻醉后固定于鼠板上，經(jīng)膈肌心臟放血處死大鼠并收集血液1 mL，4℃ 4 000 r/min離心20 min收集血清；消毒頸部皮膚，暴露頸部氣管，用5 mL滅菌注射器針頭呈30°角輕柔插入氣管1/2處，隨后水平進(jìn)針約2.5 cm并固定，結(jié)扎右側(cè)肺門，將5 mL 4℃預(yù)冷滅菌生理鹽水灌入左肺，間隔1 min后緩慢回抽，反復(fù)3次為灌洗1次，共灌洗2次，收集所有的肺泡灌洗液，4℃ 1 500 r/min離心10 min收集上清，與血清一起置于-80℃冰箱保存，備用。

1.2.3 大鼠肺組織的收集 分離肺組織，取右上、中葉肺組織于-80℃保存，用于蛋白印跡法檢測Dectin-1蛋白的表達(dá)量；取右下肺置于10%多聚甲醛固定、脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片HE染色。

1.2.4 IL-17、IL-23含量的檢測 采用ELISA法檢測。取3組大鼠血清及肺泡灌洗液的上清液標(biāo)本各100 μL，所有標(biāo)本均設(shè)2個(gè)復(fù)孔檢測，嚴(yán)格按照IL-17、IL-23試劑盒說明書的操作步驟檢測標(biāo)本中IL-17、IL-23含量，得到的結(jié)果以pg/mL表示。

1.2.5 Dectin-1蛋白表達(dá)量的檢測 采用Western Blot法進(jìn)行。取凍存的肺組織50 mg進(jìn)行組織勻漿，離心后取上清即為總蛋白，用BCA蛋白濃度定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGA電泳，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，室溫封閉2 h后分別加入Dectin-1一抗(1∶2 000)、β-actin一抗(1∶4 000) 4°C孵育過夜，洗滌3次后加入二抗室溫孵育1 h，洗滌3次后用ECL化學(xué)試劑發(fā)光，用ChemiDo-eXRS圖像采集系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件檢測條帶灰度值，以Dectin-1蛋白目的條帶與內(nèi)參蛋白β-actin條帶的灰度比值作為Dectin-1蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及病情觀察 實(shí)驗(yàn)過程中，A組大鼠全程進(jìn)食、飲水及活動(dòng)無明顯改變，精神好，較活躍，毛發(fā)光亮。B組大鼠活動(dòng)在氣管給藥結(jié)束后第1天無明顯改變，第3天及第5天逐漸有大鼠出現(xiàn)進(jìn)食及飲水減少，精神稍差，活動(dòng)較前減少,體重逐漸下降。C組大鼠從給藥結(jié)束后第1天即開始出現(xiàn)食欲下降，進(jìn)食及飲水明顯減少，精神差，嗜睡，活動(dòng)明顯減少，口鼻部位出現(xiàn)淤血點(diǎn)，糞便軟爛，體重明顯下降，并且上述癥狀隨時(shí)間加重。大鼠平均體重變化情況見圖1。

圖1 三組大鼠平均體重變化情況

Figure1Changes in average body weight of three groups of rats

2.2 肺組織病理學(xué)改變

2.2.1 肉眼觀察 肉眼見A組大鼠肺組織形態(tài)正常，質(zhì)軟，表面光滑呈粉紅色，無充血、水腫，邊緣銳薄。B組大鼠肺組織第1天稍腫脹，第3天及第5天可見充血、水腫，表面有散在質(zhì)韌的灰白色病灶，第5天較第3天充血、水腫明顯。C組大鼠肺組織病變最嚴(yán)重，充血、水腫明顯，觸之較硬、彈性差，表面有大小不一的灰白色病灶，病變程度隨時(shí)間逐漸加重。

2.2.2 HE染色觀察 顯微鏡下可見A組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺間隔完整，無充血或炎性細(xì)胞浸潤，第1、3、5天無明顯改變。B組大鼠部分肺泡塌陷，肺泡腔及肺間隔可見炎性細(xì)胞浸潤，可見肺組織出血，病變嚴(yán)重程度隨時(shí)間進(jìn)行性加重。C組大鼠肺組織病變最嚴(yán)重，大部分肺泡塌陷，界限不清晰，病灶之間有大量炎性細(xì)胞浸潤，肺組織出血、壞死明顯，病變嚴(yán)重程度隨時(shí)間進(jìn)行性加重。見圖2。

A1.1(×200 倍) 及A1.2(×400 倍)為空白對照組；B1.1、B2.1、B3.1(×200 倍)及B1.2、B2.2、B3.2(×400 倍)分別為B組第1、3、5天；C1.1、C2.1、C3.1(×200 倍)及C1.2、C2.2、C3.2(×400 倍)分別為C組第1、3、5天

圖2三組大鼠肺組織病理檢查結(jié)果

Figure2Pathological examination results of lung tissue in three groups of rats

2.3 三組大鼠血清中IL-17、IL-23的含量及影響因素比較 A組大鼠血清中IL-17、IL-23含量在三組中均最低，B組和C組大鼠血清中IL-17、IL-23含量均隨時(shí)間增高，同時(shí)IL-17、IL-23含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均是C組最高，B組次之，A組最低。采用多元回歸分析得到對大鼠進(jìn)行免疫抑制、大鼠真菌感染及感染后的時(shí)間長短均分別對血清中IL-17、IL-23含量有影響，其中應(yīng)用免疫抑制劑對血清中IL-17、IL-23含量影響均最大；對血清中IL-17含量而言感染后的時(shí)間影響次之，真菌感染影響程度最低；對血清中IL-23含量而言，真菌感染影響程度次之，感染后時(shí)間影響程度最低。見表1、2。

表1 各時(shí)間點(diǎn)三組大鼠血清中IL-17、IL-23含量(pg/mL，n=6)

表2 血清中IL-17 、IL-23濃度的影響因素

2.4 三組肺泡灌洗中IL-17、IL-23含量及及影響因素比較 A組肺泡灌洗液中IL-17、IL-23含量在三組中均最低，B組和C組大鼠肺泡灌洗液中IL-17、IL-23含量均隨時(shí)間增高，同時(shí)IL-17、IL-23含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均是C組最高，B組次之，A組最低。采用多元回歸分析得到對大鼠進(jìn)行免疫抑制、大鼠真菌感染及感染后的時(shí)間長短均分別對肺泡灌洗液中IL-17及IL-23含量有影響，其中應(yīng)用免疫抑制劑對兩種炎癥因子含量影響程度最大，進(jìn)行真菌感染影響程度次之，感染后時(shí)間長短影響程度最低。以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、4。

表3 各時(shí)間點(diǎn)三組大鼠肺泡灌洗液中IL-17、IL-23濃度(pg/mL，n=6)

表4 肺泡灌洗液中IL-17、IL-23濃度的影響因素

2.5 相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)發(fā)現(xiàn)，B組：(1)血清中IL23和IL17呈正相關(guān)；(2)肺泡灌洗液中IL23和IL17兩個(gè)因子也呈正相關(guān)(r分別為0.885、0.849，均P<0.05)。C組：(1)血清中IL23和IL17呈正相關(guān)；(2)肺泡灌洗液中IL23和IL17兩個(gè)因子也呈正相關(guān)(r分別為0.675、0.680，均P<0.05)。IL-17在大鼠血清及肺泡灌洗液中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.967，P<0.05)，IL-23在大鼠血清及肺泡灌洗液中的表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.886，P<0.05)。

2.6 三組大鼠肺組織 Dectin-1 蛋白表達(dá)量及影響因素分析 A組第1、3、5天Dectin-1蛋白表達(dá)均很低。B組和C組大鼠肺組織 Dectin-1 蛋白表達(dá)量隨感染時(shí)間增加而增高，第1、3、5天均是C組蛋白表達(dá)量最高，B組次之，A組表達(dá)量最低。采用多元回歸分析得到對大鼠進(jìn)行免疫抑制、大鼠真菌感染及感染后的時(shí)間長短均分別對肺組織 Dectin-1 蛋白表達(dá)量含量有影響，其中應(yīng)用免疫抑制劑對Dectin-1 蛋白表達(dá)量影響程度最大，真菌感染影響程度次之，感染后時(shí)間長短影響程度最低。以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3及表5、6。

圖3 各時(shí)間點(diǎn)三組大鼠肺組織Dectin-1蛋白的表達(dá)情況

Figure3Expression of Dectin-1 protein in lung tissue in three groups of rats at different time points

表5各時(shí)間點(diǎn)三組大鼠肺組織Dectin-1蛋白的相對表達(dá)量(n=3)

Table5Relative expression of Dectin-1 protein of lung tissue in three groups of rats at different time points(n=3)

分組第1天第3天第5天A組0.16±0.010.15±0.020.17±0.01B組0.20±0.030.32±0.050.46±0.05C組0.49±0.080.63±1.100.77±0.07

表6大鼠肺組織Dectin-1蛋白相對表達(dá)含量的影響因素

Table6Influencing factors for relative expression of Dectin-1 protein in lung tissue

變量回歸系數(shù)及95%CI標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)P免疫抑制劑0.30(0.23,0.37)0.653<0.001真菌感染0.16(0.10,0.24)0.360<0.001感染后時(shí)間0.09(0.06,0.13)0.345<0.05

3 討論

人體的免疫系統(tǒng)分為固有免疫系統(tǒng)(innate immunity)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(adaptive immunity)，當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體時(shí)首要面對的是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)。在固有免疫中，對機(jī)體而言最大的挑戰(zhàn)就是通過有限的受體迅速識(shí)別大量不同的病原體并作出應(yīng)答。系統(tǒng)性念珠菌病的宿主防御主要依靠吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)對真菌細(xì)胞的攝取和殺死。

機(jī)體固有免疫系統(tǒng)通過病原模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別入侵真菌的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，激活免疫應(yīng)答。真菌細(xì)胞壁作為最外層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在真菌的致病性中起著重要作用[5]。真菌細(xì)胞壁是由β-葡聚糖、幾丁質(zhì)和甘露糖蛋白組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu),而β-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁最內(nèi)層結(jié)構(gòu)，作為重要的PAMP被外層的甘露糖-甘露聚糖蛋白層覆蓋，從而阻止了PRRs對β-葡聚糖的直接識(shí)別[6]。Goodridge等[7]發(fā)現(xiàn)通過熱處理能破壞白假絲酵母菌菌細(xì)胞壁外層的甘露聚糖-甘露糖蛋白結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁內(nèi)層的β-葡聚糖得以暴露，從而被C型凝集素受體家族識(shí)別，進(jìn)而啟動(dòng)固有免疫開始發(fā)揮抗真菌作用。而本課題組前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過熱處理的光滑假絲酵母菌與活光滑假絲酵母菌同樣具有較強(qiáng)的致病性。本研究先建立大鼠免疫抑制狀態(tài)再經(jīng)氣管感染熱處理光滑假絲酵母菌，發(fā)現(xiàn)免疫抑制感染組大鼠較直接感染組大鼠一般情況更差，病情更嚴(yán)重，肺組織的炎性細(xì)胞浸潤、充血及肺泡結(jié)構(gòu)破壞等炎性病變更顯著，說明成功建立了大鼠熱侵襲性熱處理光滑假絲酵母菌肺部感染模型，同時(shí)可以推測光滑假絲酵母菌通過熱處理同樣可以破壞了光滑假絲酵母菌細(xì)胞壁外層結(jié)構(gòu)甘露聚糖-甘露糖蛋白結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁內(nèi)層的β-葡聚糖得以暴露從而被PRRs識(shí)別，進(jìn)而啟動(dòng)固有免疫開始發(fā)揮抗真菌作用。

C型凝集素受體(CCRs)屬于PRRs家族，C型凝集素(如MR、Dectin．1、Dectin-2、DC-SIGN、Min-cle)，可以介導(dǎo)宿主細(xì)胞對真菌的黏附和吞噬，并激活細(xì)胞內(nèi)信號通路產(chǎn)生抗真菌效應(yīng)，包括細(xì)胞因子的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激。Dectin-1受體通過識(shí)別真菌細(xì)胞壁表面的β-葡聚糖，激活酪氨酸激酶(SyK)和Raf-1途徑，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-23等，在真菌的識(shí)別和免疫應(yīng)答中起到重要作用，并且參與影響THl、TH17的分化[9]。本研究通過Western Blot方法檢測大鼠肺組織中Dectin-1蛋白的表達(dá)量及通過回歸分析影響蛋白含量的因素，可以看出真菌感染的B組和C組的大鼠Dectin-1蛋白表達(dá)量較未感染的A組明顯增高，同時(shí)真菌感染的B組和C組中的蛋白表達(dá)量均隨感染時(shí)間增加而增高，說明當(dāng)熱處理光滑假絲酵母菌感染機(jī)體后，單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞上的Dectin-1受體通過直接識(shí)別真菌細(xì)胞壁表面的β-葡聚糖，激活機(jī)體天然免疫產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子對抗真菌感染。而免疫抑制感染組大鼠Dectin-1蛋白表達(dá)量從感染后第1天開始就較對照組及直接感染組明顯增高，肺組織病理改變更嚴(yán)重，并且經(jīng)過回歸分析得到進(jìn)行免疫抑制對Dectin-1蛋白含量影響最大，提示在等量致病菌感染機(jī)體時(shí)，免疫抑制狀態(tài)下的大鼠較未免疫抑制的大鼠在光滑假絲酵母菌感染早期Dectin-1通路就被更多地激活，并產(chǎn)生大量的炎癥因子及趨化因子，誘發(fā)更強(qiáng)烈的肺部炎癥反應(yīng)。

輔助性17細(xì)胞(Th17細(xì)胞)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，能分泌多種細(xì)胞因子，包括IL-17、IL-21、IL-22和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，在維持黏膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用,有助于對抗細(xì)菌和真菌等病原體的入侵[10]。IL-17具有強(qiáng)大的促炎作用，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子將吞噬細(xì)胞募集到免疫反應(yīng)部位，增強(qiáng)機(jī)體對抗真菌感染的保護(hù)性免疫作用。在原發(fā)肺曲霉菌感染患者中，能檢測到T細(xì)胞TH17型表型特異性表達(dá)[11]；IL-17缺陷小鼠比正常小鼠更易患系統(tǒng)性念珠菌病，在白假絲酵母菌感染后，TH17細(xì)胞能在感染后早期產(chǎn)生IL-17，在獲得性免疫建立之前發(fā)揮重要作用[12]。而IL-23不僅能刺激并維持TH17細(xì)胞分化，促進(jìn)IL-17因子大量表達(dá)，同時(shí)IL-23本身還能通過記憶T細(xì)胞的擴(kuò)增產(chǎn)生大量巨噬細(xì)胞集落刺激因子來促進(jìn)單核細(xì)胞分化，與IL-17一起參與炎癥反應(yīng)[13]。已有研究[14-16]證實(shí)，在白假絲酵母菌感染及黃曲霉菌引起的超敏性肺炎中，Dectin-1通過誘導(dǎo)由IL-12的p19和p40亞基組成的IL-23等Th17驅(qū)動(dòng)細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的應(yīng)答。本研究通過ELISA法檢測大鼠血清和肺泡灌洗液中IL-17、IL-23含量的變化，發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均是C組IL-17及IL-23的含量最高，B組含量次之，A組含量最低且無明顯變化，對血清及肺泡灌洗液中兩種炎癥因子含量的影響因素進(jìn)行回歸分析可以得出，真菌感染的B組和C組的大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-17、IL-23兩種炎癥因子含量均較未感染的A高，并且B組和C組兩種因子隨感染時(shí)間增加而增高，同時(shí)B組和C組大鼠血清和肺泡灌洗液中IL-23的濃度均與IL-17濃度呈正相關(guān)，提示光滑假絲酵母菌模型建立成功后，IL-17、IL-23全程參與抗光滑假絲酵母菌免疫過程，并且兩種炎性因子的增長趨勢與Dectin-1蛋白變化趨勢與文獻(xiàn)[17-19]研究的結(jié)果一致，可以推測在大鼠侵襲性肺部光滑假絲酵母菌感染過程中，感染早期Dectin-1通路被激活后同樣刺激IL-23分泌，IL-23 不僅參與誘導(dǎo)原始CD4+T細(xì)胞向TH17細(xì)胞分化并產(chǎn)生大量IL-17，之后IL-23還與IL-17共同發(fā)揮促炎作用，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，將吞噬細(xì)胞募集到免疫反應(yīng)部位，增強(qiáng)機(jī)體對抗真菌感染的保護(hù)性免疫作用。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在處于免疫抑制狀態(tài)的免疫抑制感染組各時(shí)間點(diǎn)Dectin-1蛋白和IL-17、IL-23兩種炎性因子的含量均較直接感染組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)免疫抑制感染組大鼠肺組織較直接感染組有更多的炎性細(xì)胞浸潤，肺組織結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重，推測當(dāng)機(jī)體處于免疫力低下或者免疫抑制狀態(tài)時(shí)，Dectin-1通路被過多激活產(chǎn)生更多下游炎性因子，過量表達(dá)的IL-17、IL-23募集過量炎性因子反而可能加重肺組織損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)免疫抑制感染組、直接感染組大鼠肺泡灌洗液中IL-17、IL-23含量均比同組相同時(shí)間點(diǎn)的血清中高，結(jié)合本課題組前期對大鼠氣道上皮細(xì)胞感染光滑假絲酵母菌的研究[20]，推測通過氣管插管給予熱處理光滑假絲酵母菌感染時(shí)，大鼠氣道上皮細(xì)胞首先受到感染，其Dectin-1受體最先被激活，誘發(fā)IL-23的等炎癥因子釋放，促使TH17細(xì)胞分化并產(chǎn)生IL-17，首先引起肺部感染進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)，使肺泡灌洗液中IL-17、IL-23含量高于血清，而當(dāng)存在免疫抑制時(shí)，更嚴(yán)重的肺部炎癥病變使這種差距更明顯。結(jié)合上述研究結(jié)果可將對機(jī)體抗念珠菌病的炎癥反應(yīng)設(shè)想為雙刃劍，過度增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)反而可能加重機(jī)體損傷，因此，Dectin-1信號應(yīng)由許多負(fù)性調(diào)節(jié)因子嚴(yán)格控制，以終止免疫和炎癥反應(yīng)并防止過度炎癥反應(yīng)發(fā)生。

綜上所述，在大鼠肺部感染熱處理光滑假絲酵母菌后，Dectin-1通路早期被激活并產(chǎn)生IL-6、IL-23等細(xì)胞因子，其中IL-23參與誘導(dǎo)TH17細(xì)胞分化并促進(jìn)IL-17產(chǎn)生，之后IL-17、IL-23與Dectin-1通路產(chǎn)生的其他炎性因子一起共同參與抗真菌的免疫過程，并且過強(qiáng)的IL-17、IL-23表達(dá)還可能參與介導(dǎo)肺組織損傷，若能使用Dectin-1受體抑制劑可能對減輕肺部炎癥有一定作用。應(yīng)當(dāng)指出，目前關(guān)于Th17應(yīng)答的大多數(shù)結(jié)果均來自于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，人類Th17的分化過程可能與大鼠Th17的分化不完全相同，尚需進(jìn)一步研究。而本研究從分子水平探索光滑假絲酵母菌及其PRR的致病性以及宿主免疫應(yīng)答過程，希望能為今后臨床上侵襲性光滑假絲酵母菌的感染及免疫治療提供新思路和理論依據(jù)。