菊黃東方鲀魚(yú)精蛋白提取工藝優(yōu)化研究

劉淑集，陳梧英，許 旻，李 輝，蘇永昌，張伯超，喬 琨，蘇 捷，劉智禹

(1福建省水產(chǎn)研究所，國(guó)家海水魚(yú)類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心(廈門(mén))，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén) 361013；2閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000)

河鲀(Tetraodontidae)，俗稱“河豚魚(yú)”，屬于脊索動(dòng)物門(mén)、鲀形目、鲀科，是一種高蛋白、低脂肪的魚(yú)類(lèi)，具有很高的食用價(jià)值，野生河鲀有劇毒。雄性河鲀性成熟期的精巢(俗稱魚(yú)白)占整個(gè)雄魚(yú)體質(zhì)量的7 %[1]以上。除蟲(chóng)紋東方鲀(Takifuguvermicularis)精巢含有河豚毒素外，其他品種的精巢基本不含[2-3]。2016年，農(nóng)業(yè)部等聯(lián)合發(fā)布《關(guān)于有條件放開(kāi)養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經(jīng)營(yíng)的通知》[4]；福建省也發(fā)布了關(guān)于加快推進(jìn)養(yǎng)殖河鲀產(chǎn)業(yè)發(fā)展的實(shí)施意見(jiàn)，推進(jìn)菊黃東方鲀(TakifuguFlavidus)和雙斑東方鲀(Takifugubimaculatus)的人工養(yǎng)殖。據(jù)統(tǒng)計(jì)，福建省河鲀養(yǎng)殖面積約10萬(wàn)畝(6 666.67 hm2)，產(chǎn)量9 200 t，占全國(guó)河鲀養(yǎng)殖總產(chǎn)量30%左右[5]。

魚(yú)類(lèi)精巢中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其中魚(yú)精蛋白是利用價(jià)值較高的蛋白質(zhì)。魚(yú)精蛋白是一種富含精氨酸的天然多聚陽(yáng)離子堿性蛋白質(zhì)，通常與魚(yú)精脫氧核糖核苷酸以1∶2的比例結(jié)合，形成精核蛋白存在于魚(yú)類(lèi)精巢組織中[6]。魚(yú)精蛋白成分天然，安全性較高[7]，具有良好的廣譜抗菌特性[8-10]。此外，魚(yú)精蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥理功能特性[11-12]，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前魚(yú)精蛋白主要是從鱒魚(yú)、鯡魚(yú)、鮭魚(yú)、鯉魚(yú)、魷魚(yú)等[13-14]提取。常用的魚(yú)精蛋白提取方法主要是利用NaCl溶液溶解硫酸或鹽酸提取，再利用冷乙醇沉淀獲得[15-18]，而從河鲀提取魚(yú)精蛋白的報(bào)道還未見(jiàn)。本研究以菊黃東方鲀精巢為原料，進(jìn)行河鲀魚(yú)精蛋白提取工藝研究，獲得提取魚(yú)精蛋白最佳工藝條件，為提取河鲀魚(yú)精蛋白的相關(guān)研究提供工藝參考，也為河鲀加工產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料：菊黃東方鲀凍干精巢，購(gòu)自福建省鲀之鮮水產(chǎn)有限公司，真空冷凍干燥；濃硫酸(分析純)、NaCl(分析純)、磷酸(分析純)、考馬斯亮藍(lán)G-250(分析純)，均產(chǎn)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇(分析純)，產(chǎn)自上海泰坦科技股份有限公司；河豚毒素ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自江蘇美正生物科技有限公司。

試驗(yàn)儀器：pH計(jì)(PB-10，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(centrifuge 5810R，德國(guó) Eppendorf)；電子分析天平(BS 124S，德國(guó)Sartorius)；超低溫冰箱(Forma -86 ℃，美國(guó)Thermo)；酶標(biāo)儀(M200 PRO，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司)；渦旋混合儀(XW-80A，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D，鞏義市予華儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6，常州國(guó)華電器有限公司)；數(shù)顯磁力攪拌器(C-MAG HS7，艾卡中國(guó)儀器設(shè)備有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(寧波新藝生物科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 河鲀精巢成分及安全性測(cè)定

水分參照GB/T 5009.236—2016 中的直接干燥法測(cè)定[19]；粗蛋白質(zhì)參照GB 5009.5—2016 中的凱氏定氮法測(cè)定[20]；粗脂肪參照GB/T 5009.6—2016 中的索氏抽提法測(cè)定[21]；灰分測(cè)定參照GB/T 5009.4—2016 中的灼燒稱重法測(cè)定[22]。河豚毒素( TTX ) 按照河豚毒素ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[23]為：TTX ≥ 1 000 MU/g為劇毒，記為A級(jí)；100～999 MU/g為強(qiáng)毒，記為B級(jí)；10～99MU/g為弱毒，記為C級(jí)；<10 MU/g為無(wú)毒，記為D級(jí)，1MU=0.18 μg/g TTX。

1.2.2 魚(yú)精蛋白提取工藝

魚(yú)精蛋白提取工藝參照胡曉璐等[24]、饒丹華等[25]的方法并稍作修改。稱取10.00 g的河鲀精巢干制品，加入100 mL不同pH、濃度為 0.14 mol/L的NaCl溶液，攪碎勻漿2 min，置于25 ℃下，10 000 r/min離心20 min，棄上清液。在沉淀物中按照比例加入硫酸溶液，在設(shè)定的溫度條件下提取一定時(shí)間，6 000 r/min離心15 min，取上清液。加入不定量體積無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀，靜置過(guò)夜，8 000 r/min離心15 min，取沉淀液置于培養(yǎng)皿內(nèi)，吹風(fēng)晾干，在-20 ℃冰箱中凍藏一夜，真空冷凍干燥，所得干制品即為魚(yú)精蛋白粗提物。此試驗(yàn)設(shè)置重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.3 試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定

魚(yú)精蛋白提取率計(jì)算：真空冷凍干燥后取出樣品，稱取其重量，采用魚(yú)精蛋白提取率Y表示：

Y=100%×(E/M)

(1)

式中：Y—魚(yú)精蛋白提取率；E—凍干后魚(yú)精蛋白粗提物，g；M—凍干河豚精巢，g。

1.2.4 魚(yú)精蛋白提取條件單因素試驗(yàn)

以魚(yú)精蛋白提取率為指標(biāo)，在固定其他影響因素保持不變的狀態(tài)下，分別考察硫酸濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)、pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、硫酸用量(離心所得沉淀體積的1、2、3、4、5倍)、提取時(shí)間(1、2、3、4、5 h)、提取溫度(4 ℃、25 ℃、45 ℃、65 ℃、85 ℃)、乙醇用量(分別設(shè)定為離心所得上清液體積的1、2、3、4、5倍)對(duì)魚(yú)精蛋白提取效果的影響，每個(gè)水平試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化魚(yú)精蛋白提取工藝條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取NaCl溶液pH(A)、硫酸用量(B)與提取時(shí)間(C)3個(gè)因素作為自變量，以魚(yú)精蛋白提取率(Y)作為響應(yīng)值，在pH(7、8、9)、硫酸用量(3、4、5倍)和提取時(shí)間(1.5、2、2.5 h)3因素3水平上對(duì)魚(yú)精蛋白提取條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果與分析

2.1 河鲀精巢成分測(cè)定結(jié)果

從菊黃東方鲀精巢成分的分析結(jié)果可以看出，凍干精巢的成分含量從高到低排列依次為蛋白質(zhì)(78.0%)、灰分(10.4%)、粗脂肪(5.8%)、水分(5.0%)、碳水化合物(0.8%)，蛋白質(zhì)占比最大，可見(jiàn)該河鲀精巢中含有豐富的蛋白質(zhì)，而魚(yú)精蛋白是其中的主要蛋白，且具有良好的功能特性。同時(shí)對(duì)菊黃東方鲀精巢的河豚毒素進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果低于限值，屬于D級(jí)(無(wú)毒)，說(shuō)明精巢是安全無(wú)毒的，與Itoi等[26]的研究結(jié)果一致。

2.2 各單因素對(duì)河鲀魚(yú)精蛋白提取率的影響

2.2.1 NaCl溶液pH的影響

NaCl溶液的pH對(duì)魚(yú)精蛋白的提取影響顯著。魚(yú)精蛋白為偏堿性蛋白質(zhì)，保持中性至偏堿性，有利于魚(yú)精蛋白的提取[27-28]。圖1為各因素對(duì)魚(yú)精蛋白提取率的影響結(jié)果。由圖1a可知，隨著溶液堿性的提高，魚(yú)精蛋白提取率逐漸升高，當(dāng)?shù)竭_(dá)pH10時(shí)，提取率顯著下降。因此，選取pH 8作為最佳提取點(diǎn)。

圖1 各單因素對(duì)魚(yú)精蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of every single factor on the extraction rate of protamine

2.2.2 硫酸濃度的影響

魚(yú)精蛋白的提取率在低濃度范圍內(nèi)受硫酸濃度的影響顯著。從圖1b可知，硫酸濃度在0.2～0.6 mol/L中變化時(shí)，魚(yú)精蛋白的含量明顯增加，濃度到達(dá)0.6 mol/L時(shí)，魚(yú)精蛋白的提取率達(dá)到最大值，之后隨著硫酸濃度的繼續(xù)增加，魚(yú)精蛋白的提取率反而呈下降趨勢(shì)，當(dāng)濃度增至0.8～1.0 mol/L之間時(shí)，提取率呈穩(wěn)定趨勢(shì)，說(shuō)明魚(yú)精蛋白的提取已接近飽和狀態(tài)，再高濃度的硫酸可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，降低提取率。因此，選取硫酸濃度為0.6 mol/L作為提取最佳濃度。

2.2.3 硫酸用量的影響

硫酸用量對(duì)魚(yú)精蛋白的提取影響顯著。如圖1c所示，魚(yú)精蛋白的提取率隨著硫酸用量的增加呈先升后降的趨勢(shì)，在1～2倍沉淀體積下魚(yú)精蛋白溶解度較小，在2～4倍沉淀體積時(shí)提取率明顯提高，隨著硫酸用量的增加，魚(yú)精蛋白與提取液的相互結(jié)合能力明顯增強(qiáng)，但用量繼續(xù)增加到5倍時(shí)，操作過(guò)程的繁瑣程度增加，且轉(zhuǎn)移溶液以及離心過(guò)程中的誤差增大，提取率反而降低?？紤]到成本以及提取率含量值，選擇硫酸用量在4.0倍沉淀體積時(shí)為最佳。

2.2.4 提取溫度的影響

提取溫度對(duì)魚(yú)精蛋白的影響如圖1d所示。在較低溫度范圍內(nèi)，魚(yú)精蛋白提取率的變化趨勢(shì)較為平緩，而在較高溫度范圍內(nèi)提取率急劇降低。當(dāng)溫度到達(dá)45 ℃時(shí)提取率達(dá)到峰值，效果顯著。適當(dāng)提高溫度對(duì)于提高魚(yú)精蛋白提取率有積極作用。這可能是因?yàn)椋m當(dāng)提高溫度能增大分子之間的相互作用，提高分子運(yùn)動(dòng)的速度，從而增大蛋白質(zhì)分子的溶解性[25]，但溫度進(jìn)一步升高會(huì)破壞蛋白質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)，所提取得到的魚(yú)精蛋白呈黃色甚至偏褐色狀態(tài)，且后續(xù)表現(xiàn)出的水溶性較差。因此，選取45 ℃作為最佳提取溫度較為合適。

2.2.5 提取時(shí)間的影響

由圖1e可知，提取時(shí)間在1～2 h內(nèi)，魚(yú)精蛋白的提取速度增長(zhǎng)明顯，在2 h時(shí)達(dá)到最大值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸降低。這可能是由于提取過(guò)程中，魚(yú)精蛋白與提取液的相互作用減弱，達(dá)到相對(duì)平衡后難以繼續(xù)升高，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液與被提取物中的其他物質(zhì)發(fā)生結(jié)合，易導(dǎo)致雜質(zhì)增多。因此，以2 h為最佳提取時(shí)間。

2.2.6 乙醇用量的影響

乙醇用量對(duì)魚(yú)精蛋白提取率的影響如圖1f。隨著乙醇用量的增加，魚(yú)精蛋白提取率先明顯上升，后逐漸趨于平緩。魚(yú)精蛋白的提取率起先變幅較小，隨著使用倍數(shù)增加提取率迅速上升，當(dāng)達(dá)到4.0倍沉淀體積用量時(shí)，魚(yú)精蛋白的溶解呈現(xiàn)飽和狀態(tài)，而后逐漸平緩，說(shuō)明魚(yú)精蛋白的提取接近穩(wěn)定。因此，選取4.0倍沉淀體積乙醇用量作為最佳沉淀劑用量。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

對(duì)各單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間顯著性分析發(fā)現(xiàn)，硫酸用量、提取時(shí)間、pH及乙醇用量4個(gè)因素在設(shè)定的水平之間均有顯著性差異(P=0.000、0.000、0.016、0.016)。由于乙醇是后續(xù)用來(lái)沉淀蛋白的，用量比較大，后續(xù)還要離心，操作繁瑣，因此選擇以NaCl溶液pH(A)、硫酸用量(B)、提取時(shí)間(C)作為自變量，以魚(yú)精蛋白提取率(Y)作為因變量，應(yīng)用Design-Expert軟件，進(jìn)行3因素3水平的魚(yú)精蛋白提取條件優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab.1 Design scheme and result of response surface methodology

以魚(yú)精蛋白提取率(Y)關(guān)于NaCl溶液pH(A)、硫酸用量(B)、提取時(shí)間(C)所建立的二次回歸響應(yīng)面模型，如以下方程所示：

Y=-38.528+9.374A+5.162B+5.752C+0.034AB+1.424AC-0.603BC-0.759A2-0.491B2-3.168C2

2.3.1 方差分析

二次模型的方差分析結(jié)果(表2)顯示，模型P=0.042 5<0.05，說(shuō)明魚(yú)精蛋白提取率的回歸方程模型顯著；失擬項(xiàng)P=0.143 8>0.05，失擬不顯著，回歸方程較為可靠，回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可準(zhǔn)確模擬各個(gè)因素對(duì)河鲀魚(yú)精蛋白提取率的影響，且預(yù)測(cè)值能較好地與實(shí)際操作計(jì)算出的魚(yú)精蛋白提取率相吻合。

表2 回歸模型的方差分析結(jié)果Tab.2 Variance analysis of the regression model

2.3.2 響應(yīng)面分析

各因素對(duì)魚(yú)精蛋白提取率影響的交互作用響應(yīng)面及等高線圖如圖2所示。NaCl溶液的pH與提取時(shí)間對(duì)魚(yú)精蛋白提取率影響的交互作用效果如圖2a、2b所示，隨著提取時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)和NaCl溶液pH的增加，魚(yú)精蛋白的提取率先升高后下降，交互曲面整體呈現(xiàn)凸起，呈倒U型變化，且等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明NaCl溶液的pH與提取時(shí)間二者有一定交互作用。圖2c、2d中，隨著NaCl溶液pH的增大，魚(yú)精蛋白的提取率先升高后降低，隨著硫酸用量的加大，也呈現(xiàn)先升高后微降低并趨于穩(wěn)定的態(tài)勢(shì)，二者交互后整體曲面的變化趨勢(shì)相對(duì)圖2a的曲面比較平緩，但其等高線圖仍呈橢圓形，說(shuō)明NaCl溶液pH和硫酸用量存在交互作用。而在圖2e、2f中，魚(yú)精蛋白提取率隨著提取時(shí)間的增加逐漸提高，隨著硫酸用量的加大也緩慢增加，從相互作用的等高線圖看，二者之間的交互作用不明顯。

通過(guò)Design-Expert8.0分析軟件，得到河鲀精巢魚(yú)精蛋白的最佳提取條件是：NaCl溶液pH 8.55，硫酸濃度0.6 mol/L，硫酸用量為離心所得4.05倍沉淀體積，提取率預(yù)測(cè)值19.02%。為了便于實(shí)際操作，將模型優(yōu)化出的最優(yōu)提取條件簡(jiǎn)化為：NaCl溶液pH 8.5，硫酸用量為離心所得4.0倍沉淀體積，提取時(shí)間2.4 h，硫酸濃度0.6 mol/L，提取溫度45 ℃，乙醇用量為上清液的4.0倍沉淀體積。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算得到魚(yú)精蛋白的提取率為19.07%，與預(yù)測(cè)值相比沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明此響應(yīng)面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

3 結(jié)論

檢測(cè)了菊黃東方鲀精巢的河豚毒素含量，證實(shí)其屬于無(wú)毒級(jí)別。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面應(yīng)用于優(yōu)化河鲀精巢魚(yú)精蛋白的提取，結(jié)果表明，響應(yīng)面優(yōu)化河鲀精巢魚(yú)精蛋白提取方法合理可行，得到最佳的提取工藝條件為：NaCl溶液pH 8.5，硫酸用量4.0倍沉淀體積，提取時(shí)間2.4 h，硫酸濃度0.6 mol/L，提取溫度45 ℃，乙醇用量為4.0倍沉淀體積，魚(yú)精蛋白實(shí)際提取率為19.07%。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線 Fig.2 Response surface diagrams and contour of interaction between every factor

從河鲀精巢提取魚(yú)精蛋白，對(duì)于研究魚(yú)精蛋白的理化特性以及相關(guān)功能特性提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，能夠起到有效利用河鲀精巢組織的作用。未來(lái)關(guān)于魚(yú)精蛋白的研究需要進(jìn)一步深入，繼續(xù)改進(jìn)、創(chuàng)新以提高魚(yú)精蛋白的提取率，增加魚(yú)精蛋白提取純度，最終能適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)需要。

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