棉花遺傳多樣性分析SSR標記的快速預(yù)篩

姜輝，王永翠，高明偉，王秀麗，陳瑩，王家寶，柴啟超，張超，趙軍勝

（山東棉花研究中心/農(nóng)業(yè)部黃淮海棉花遺傳改良與栽培生理重點試驗室，濟南 250100）

遺傳多樣性分析是種質(zhì)資源評價的重要方面，可為育種家在種質(zhì)創(chuàng)新和親本選配過程中提供有力參考，使雜交親本的選擇更有針對性，能極大提高雜交后代育種選擇效率。在眾多用于遺傳多樣性分析的標記中，DNA 分子標記作為不受環(huán)境影響的中性標記，應(yīng)用最為廣泛，基于DNA 分子標記的分析方法成為種質(zhì)資源遺傳背景評價分析的重要手段[1-3]。其中，微衛(wèi)星標記（Simple sequence repeat，SSR）因具有易開發(fā)、多態(tài)性好、操作簡單、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析[4-14]。棉花分子標記數(shù)據(jù)庫CMD（Cotton Marker Database） 曾經(jīng)公布的棉花SSR 標記有17 448個；陸地棉測序后，南京農(nóng)業(yè)大學棉花所公布了77 996個棉花基因組SSR 標記[15]，均為棉花種質(zhì)的遺傳多樣性分析提供了大量的分子標記。但研究表明，棉花遺傳基礎(chǔ)相對狹窄，大量SSR標記在種質(zhì)資源中無多態(tài)性或者多態(tài)性較低[16-23]。在大量分子標記中快速高效地篩選出多態(tài)性較好的分子標記，是基于SSR 標記分析遺傳多樣性的基礎(chǔ)，對提高棉花種質(zhì)遺傳多樣性分析效率具有重要意義。

本研究擬對改良DNA 混合池法在棉花種質(zhì)遺傳多樣性分析SSR 標記快速篩選中的應(yīng)用進行探討，并對篩選標記的使用效果進行初步驗證，為棉花種質(zhì)親緣關(guān)系分析過程中多態(tài)性SSR 標記的快速篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

60個棉花基因組SSR 標記從CMD 網(wǎng)站下載的文件中隨機挑選，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；40 份不同的棉花種質(zhì)材料由山東棉花研究中心遺傳育種室保存提供。

1.2 方法

1.2.1DNA 混池的制作。將40 份種質(zhì)隨機排列，編號1～40。5個樣品1個混池，混池編號依次為P1～P8，P1包含材料1～5，P2包含材料6～10，依次類推；每個混合池的第1 樣品作為各自的對照。

1.2.2DNA 提取及聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)。棉花基因組DNA 提取方法參照文獻[24]；PCR 反應(yīng)體系為10 μL，包括Promega 5×Green buffer 2 μL，10 μmol·L－1dNTPs 0.5 μL，DNA 模板0.5 μL，正向和反向引物各0.5 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 5.5 μL；PCR 在T100 型梯度PCR 儀（美國伯樂公司）上運行，程序為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)，72 ℃后延伸10 min，12 ℃保存。

1.2.3多態(tài)性標記的選擇。PCR 產(chǎn)物在8%（質(zhì)量分數(shù)）的聚丙烯酰胺凝膠上分離，并用快速銀染法染色。比較混合池與對照間的差異，將差異標記進一步用于單樣品的多態(tài)性分析。

1.2.4帶型判讀及數(shù)據(jù)分析。根據(jù)標記帶型進行統(tǒng)計，陽性帶型為1，陰性帶型為0，遺傳多樣性分析軟件為NTsys2.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標記多態(tài)性篩選

經(jīng)過DNA 混合池篩選，不同分子標記在混合池間的差異表現(xiàn)不同。在60個SSR 標記中，20個分子標記在8個混池之間表現(xiàn)出差異（表1），所占比例為33.3%。多態(tài)性標記在混池中差異不盡相同，其中BNL1053、MON5553 等7個標記在8個混合池內(nèi)都表現(xiàn)出差異；MON0613、BNL3031、BNL827 等6個標記在7個混合池中表現(xiàn)出差異；而MON0362 和MON296 僅在3個混池中表現(xiàn)出差異。

2.2 分子標記多態(tài)性驗證

為檢驗該混合池法篩選差異SSR 分子標記的可靠性，用60個標記分別對40個樣品單樣進行PCR 檢測，結(jié)果顯示，對于20個有差異的標記而言，單樣品檢測中均表現(xiàn)出不同程度的差異，參見圖1（BNL2449 在8個混池中的標記帶型）和圖2（BNL2449 在部分單樣品的標記帶型）。對于40個在8個混合池間及對照間沒有表現(xiàn)出差異的標記而言，在單樣品的檢測中也沒有發(fā)現(xiàn)差異，參見圖3和圖4（BNL3264 在混池和單樣品中的檢測結(jié)果）。

表1 20個多態(tài)性SSR 標記在8個混合池中的多態(tài)性表現(xiàn)

圖1 BNL2449 在混池間的標記帶型

圖2 BNL2449 在部分單樣品的標記帶型

圖3 BNL3264 在混池間的標記帶型

圖4 BNL3264 在部分單樣品的標記帶型

2.3 混池篩選的分子標記對遺傳多樣性分析的影響

為了驗證混合池篩選出的標記在遺傳多樣性中分析的效果，分別挑選了在混合池篩選中差異較大的5個標記BNL1053、MON5553、MON022、NAU1043、NAU2083 和差異較小的5個標記MON296、MON0362、NON0707、NAU802 和NAU808，根據(jù)2組標記在40樣品中的多態(tài)性數(shù)據(jù)，用NTsys 軟件進行了聚類分析，結(jié)果如圖5和圖6所示。結(jié)果顯示圖5在遺傳相似系數(shù)為0.68時可以明顯地將40份材料分為3 類，而圖6中遺傳相似系數(shù)為0.78時，40份材料才分成兩大類，并有很大一部分種質(zhì)材料無差異，這說明在遺傳多樣性分析中可優(yōu)先選擇在混合池中差異較大的標記用于種質(zhì)的遺傳多樣性評價。

3 討論與結(jié)論

基于SSR 標記的遺傳多樣性分析中，標記多態(tài)性是無法預(yù)判的，只能通過單樣品檢測才能了解，而且有關(guān)提高棉花SSR 標記篩選效率方法的研究較少。王欣怡等[20]提出通過查閱系譜，找出8份親緣關(guān)系較遠的材料對586 對候選引物進行初篩，得到190 對初篩引物，用于下一步的遺傳多樣性分析。這種方法雖然在一定程度上提高了多態(tài)性標記的預(yù)篩效率，但是需要了解部分種質(zhì)的系譜信息，這極大限制了其用于系譜信息不全的種質(zhì)的分析。此外，基于部分種質(zhì)的預(yù)篩會遺漏大部分遺傳信息。本研究將改良DNA 混池法用于遺傳多樣性標記的預(yù)篩，包含了所有分析材料的遺傳信息。結(jié)果表明，該法可有效提高棉花SSR 標記的篩選效率，可以在相對較短的時間內(nèi)將多態(tài)性較好的標記用于遺傳多樣性分析當中，同時極大降低試驗成本。

圖5 基于多態(tài)性較好的SSR 標記的遺傳聚類分析

圖6 基于多態(tài)性較差的SSR 標記的遺傳聚類分析

雖然混池法可提高標記的預(yù)篩效率[25]，但在不加對照的情況下，無法顯示池內(nèi)的多態(tài)性，只能根據(jù)混池之間的帶型不同選擇標記，容易丟失部分多態(tài)性標記。本研究提出嘗試在DNA 混合池構(gòu)建過程中，每個池選擇1個隨機對照，通過增加不同對照，減少多態(tài)性標記漏篩的概率。通過本研究的驗證，經(jīng)過不同混合池與不同對照的兩兩比對，可有效提高多態(tài)性標記的預(yù)篩效率。如圖1 所示，以P2和P3 為例，通過各自的對照6 和11，可知2個混池內(nèi)均具有多態(tài)性。池內(nèi)多態(tài)性越好的標記，其分析效果越好。

本試驗由于所用的材料相對較少，因此采用5個樣品混池的方法。在實際應(yīng)用時，可針對試驗材料數(shù)量的不同，對每個混池中的樣品數(shù)量進行調(diào)整。此外，本方法的反應(yīng)條件還需要進一步優(yōu)化。