同一SSR引物在不同棉種BAC文庫中的篩選及其FISH分析

徐俊民，崔興雷，劉玉玲，彭仁海，周忠麗，蔡小彥，王坤波，劉方*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000；2.安陽工學院，河南 安陽 455000）

棉屬共有8個二倍體基因組，分別是A、B、C、D、E、F、G和K組，這8個二倍體基因組間大小差異明顯，其中K 基因組最大（2 460 Mbp），D基因組最?。?80 Mbp）[1-2]。棉花的主要栽培種陸地棉和海島棉是由A 基因組祖先和D 基因組祖先雜交后染色體加倍形成的異源四倍體。研究棉花A、D 基因組的差別將有助于了解棉花基因組的起源進化和結(jié)構(gòu)關系，也將有助于棉花育種的研究進程。

重復序列按照其分布類型可以分為串聯(lián)型重復序列和彌散型重復序列[3]。串聯(lián)型重復序列有一定的拷貝數(shù)，一般比較保守，在染色體或基因組上成串分布。彌散型重復序列在基因組中彌散分布，在高等植物基因組中占的比例很大，在多倍體植物中所占比例更高，有的在50%以上。重復序列在基因組中的擴增會引起基因突變，導致明顯的形態(tài)變化，甚至引起數(shù)量性狀的變化[4]。

對棉花A和D基因組比較研究發(fā)現(xiàn)，重復序列含量的不同是造成2個基因組巨大差異的主要因素[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，重復序列在棉花基因組間存在擴散和互滲現(xiàn)象，尤其是四倍體中從A基因組向D基因組的擴散，Wendel將這種現(xiàn)象稱為“基因組的殖民化”[7-9]。本實驗室前期利用簡單序列重復（Simple sequence repeat，SSR）引物NAU1201在海島棉細菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）文庫中篩選到1個含有重復序列的克隆299N22，研究發(fā)現(xiàn)該克隆所含有的重復序列可能對棉花基因組的研究有較大的價值[10]。本研究利用該SSR 引物分別在阿非利加棉文庫和達爾文氏棉文庫篩選出3個和1個陽性BAC 克隆，用篩選出的BAC 克隆作探針，進行熒光原位雜交（Fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）試驗，并與之前在海島棉篩選到的BAC 克隆所產(chǎn)生的FISH 結(jié)果[10]比較。

1 材料與方法

1.1 引物和BAC文庫

SSR 引物NAU1201 被用來篩選阿非利加棉BAC 文庫[11]和達爾文氏棉BAC 文庫。阿非利加棉BAC 文庫共有75 000個克隆，共覆蓋阿非利加棉基因組5 倍，插入片段長度集中在100～150 kbp，平均115 kbp，插入片段空載率小于4%。達爾文氏棉BAC 文庫含200 832個克隆，共覆蓋達爾文氏棉基因組10 倍，插入片段長度平均為122 kbp，空載率小于2%。引物NAU1201 的序列信息來自于網(wǎng)站www.cottonmarker.org，正向引物序列： CCGATAT-CTTACTTTCCAACCT，反向引物序列：AAGGGG-TTTGAAGGGTTATC。

1.2 棉種材料

所選靶染色體為陸地棉、亞洲棉及雷蒙德氏棉的根尖有絲分裂中期染色體。這些材料在中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所的溫室均有活株，并有充裕的種子以供育苗提供根尖。采用宋國立等[12]改良的CTAB 法提取各棉種的基因組DNA。

1.3 BAC文庫的篩選

BAC 文庫的篩選采用三步聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）篩選法進行[13]。挑取篩選出的陽性單克隆培養(yǎng)，并用十二烷基磺酸鈉- 堿裂解法[14]提取質(zhì)粒DNA，用相應的SSR 引物擴增以驗證所提取質(zhì)粒的質(zhì)量。菌液PCR 反應總體積為20 μL，DNA 模板1 μL，dNTPs（0.01 mol·L－1）1.5 μL，上下游引物（1×10－5mol·L－1）各1 μL，TaqDNA 聚合酶終濃度0.025 U·μL－1，10×Reaction buffer 2.0 μL，然后用水補足20 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性10 min，94 ℃變性40 s，55℃退火40 s，72 ℃延伸1 min ，30個循環(huán)，最后72℃延伸4 min，4 ℃保存。

1.4 熒光原位雜交

種子在溫水中浸泡過夜，播種于經(jīng)煮沸消毒的潮濕的細沙中，置于光照培養(yǎng)箱中待其萌發(fā)。待根長至1～3 cm 時取根尖，浸泡于25 mg·L－1的放線菌酮中，22 ℃預處理1 h 40 min，然后用蒸餾水漂洗2 次，最后用卡諾固定液（乙醇與冰乙酸體積比為3∶1）固定2 h 以上。用4%（質(zhì)量分數(shù)）纖維素酶（Cellulase R-10，Sigma） 和2%（質(zhì)量分數(shù)） 果膠酶（Pectinase，Sigma） 混合液在37 ℃下處理根尖40 min，用60%（體積分數(shù)）乙酸壓片，隨后－80 ℃放置4 h 以上，最后揭片，4 ℃保存。陽性克隆質(zhì)粒用德國Roche 公司的Bio-Nick Translation 標記系統(tǒng)進行標記，按照其標準流程進行操作。熒光原位雜交流程按照Cui 等[10,15]的方法。雜交完成后在熒光顯微鏡（Ziess Axioskop2 plus） 下觀察熒光雜交信號，用Isis 軟件拍攝照片并調(diào)節(jié)對比度和亮度。保存FISH 照片，用Photoshop 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

用SSR 引物NAU1201 分別對達爾文氏棉和阿非利加棉基因組DNA 進行PCR 擴增，用8%（質(zhì)量分數(shù)）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物與目的片段大小一致。利用三步PCR 法分別篩選阿非利加棉和達爾文氏棉BAC 文庫，在阿非利加棉文庫中篩選出3個BAC 克隆125C20、28D13 和28D15，在達爾文氏棉文庫中篩選出1個BAC 克隆42D12（圖1）。

圖1 SSR 標記NAU1201 在達爾文氏棉和阿非利加棉BAC 文庫的篩選結(jié)果

分別用阿非利加棉的28D13 克隆和達爾文氏棉的42D12 BAC 克隆為探針，以陸地棉、亞洲棉以及雷蒙德氏棉的有絲分裂中期染色體為靶DNA 進行熒光原位雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所篩選的BAC 克隆在A（亞）組所有的染色體上都有彌散分布的信號，而在D（亞）組所有的染色體上幾乎沒有雜交信號（圖2，參見封三），該結(jié)果與在海島棉篩選到的BAC 克隆299N22 所產(chǎn)生的FISH 結(jié)果[10]一致。

3 討論與結(jié)論

本研究以本實驗室在海島棉BAC 文庫中篩選到的1個BAC 克隆為探針，對不同棉種的有絲分裂中期染色體進行熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)其在A（亞）組所有的染色體上都有強烈的彌散分布的信號，而在D（亞）組所有的染色體上幾乎沒有雜交信號[10]。測序發(fā)現(xiàn)該BAC 克隆中含有1種重復序列[16]，研究該重復序列對理解棉屬的進化有很重要的意義。本研究通過相同的引物來篩選阿非利加棉和達爾文氏棉BAC 文庫，均獲得了相應的BAC 克?。▓D2，參見封三）。這些克隆的獲得為研究該重復序列在不同棉種的分布情況以及在不同棉種中的序列差異提供了物質(zhì)基礎。

圖2 BAC克隆在不同棉種染色體上的FISH定位

本試驗用同一個SSR 引物在3個棉花BAC文庫中篩選到相似的BAC 克隆，說明該目標區(qū)域在這3個棉種基因組中保守性較強。相同的FISH雜交信號說明BAC 克隆中的這個重復序列在A基因組和A 亞組分布有一致性，該重復序列在異源四倍體形成后沒有“入侵”D 亞基因組，其大量擴增應該發(fā)生在異源四倍體棉種形成前。上述結(jié)果為含有A（亞）組特殊重復序列的BAC 克隆的獲得，研究該特殊重復序列在不同棉種基因組中的分布及進化提供了物質(zhì)基礎。

重復序列在棉花的基因組間表現(xiàn)出明顯的特異性，其在基因組中的擴增對棉屬的進化起到了十分重要的作用[17]。本試驗中這些BAC 克隆的發(fā)現(xiàn)將對研究棉花基因組結(jié)構(gòu)以及棉花A、D 基因組的起源進化提供幫助，也將有助于推動棉花的比較基因組學研究。