碳量子點(diǎn)熒光探針的設(shè)計(jì)及其在農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

白秋月，楊春亮，葉劍芝，林麗云，陳吳海

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江 524000)

農(nóng)藥殘留是農(nóng)藥使用后殘存于生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱[1]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥是農(nóng)作物增收增產(chǎn)的重要保障，但農(nóng)藥的施用量及分解量失衡會造成嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留問題[2]。大部分農(nóng)藥具有高毒性，殘留在大氣、土壤、水和農(nóng)作物中會嚴(yán)重威脅人類健康及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)[3-4]，濫用農(nóng)藥[5]將直接或間接地威脅人類的健康。食品中的農(nóng)藥殘留除了影響消費(fèi)者健康外，還與進(jìn)出口貿(mào)易、國家聲譽(yù)，乃至社會安定密切相關(guān)。近年來，國內(nèi)外因農(nóng)藥殘留引發(fā)的食品安全問題接連不斷，已成為當(dāng)今各國政府和社會各界廣為關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一[6-7]。

殘留農(nóng)藥的快速、準(zhǔn)確定量檢測是監(jiān)控農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的重要手段。缺乏快速、靈敏、高效的監(jiān)測技術(shù)已成為制約我國農(nóng)畜產(chǎn)品貿(mào)易和生產(chǎn)發(fā)展的重要因素。為了攻克這一難題，研制低毒無公害的新型農(nóng)藥，開發(fā)高靈敏度、高選擇性的農(nóng)殘檢測新技術(shù)，對農(nóng)藥使用量進(jìn)行有效控制勢在必行[8]。已報(bào)道的農(nóng)殘檢測技術(shù)如色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法和電化學(xué)分析法等靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但通常較為耗時(shí)且需要復(fù)雜的前處理過程、昂貴的儀器設(shè)備和特定的操作技能，有時(shí)還需使用有毒溶劑[9-16]。如酶聯(lián)免疫吸附法成本高、抗體合成程序耗時(shí)，且易受周圍環(huán)境影響[17-18]；電化學(xué)分析法的電極修飾程序復(fù)雜，易受假陽性影響[19]。而基于碳量子點(diǎn)的熒光探針檢測技術(shù)易操作，不需大型儀器設(shè)備，且碳量子點(diǎn)合成原料豐富、價(jià)格經(jīng)濟(jì)，在熒光探針的構(gòu)建方面表現(xiàn)出巨大的潛力，故被科研工作者廣泛關(guān)注并研究。本文簡要論述了碳量子點(diǎn)的特性、合成原料及制備方法，重點(diǎn)對碳量子點(diǎn)的修飾策略及其構(gòu)建的熒光探針在農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)且全面的綜述。

1 碳量子點(diǎn)的合成

1.1 碳量子點(diǎn)的特性

碳量子點(diǎn)(CDs)一般是指至少在一維空間的尺寸小于 10 nm，能穩(wěn)定發(fā)光的納米碳點(diǎn)，是一種分散性良好、表面富官能團(tuán)的碳納米顆粒，是繼石墨烯、碳納米管以及富勒烯之后出現(xiàn)的一種以碳為骨架結(jié)構(gòu)，以sp2雜化納米晶碳或無定形碳為核心的新型碳納米材料[20-23]。碳量子點(diǎn)具有獨(dú)特的發(fā)光性質(zhì)，其發(fā)光具有尺寸和激發(fā)波長依賴性，并且具有高的穩(wěn)定性，無光漂白現(xiàn)象，能有效克服有機(jī)染料發(fā)光不穩(wěn)定，易光漂白的缺點(diǎn)。熒光碳量子點(diǎn)除了具備量子點(diǎn)的上述優(yōu)點(diǎn)外，還具有光穩(wěn)定性高，無“光閃爍”現(xiàn)象，表面易于功能化修飾以及制備材料來源廣泛等優(yōu)勢。此外，因?yàn)樘剂孔狱c(diǎn)不含重金屬元素，所以其毒性很低，具有好的生物兼容性，不會引起重金屬污染；克服了硫化鎘等傳統(tǒng)無機(jī)量子點(diǎn)高毒、不利于廣泛應(yīng)用的缺點(diǎn)[24]。以上的諸多優(yōu)點(diǎn)，使碳量子點(diǎn)在食品安全分析領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。到目前為止，碳量子點(diǎn)已經(jīng)被成功應(yīng)用于熒光傳感檢測[25-26]。

1.2 碳量子點(diǎn)的合成原料及制備方法

CDs的合成原料來源豐富，合成方法簡單。用物理法或化學(xué)法(如激光銷蝕法、弧放電法、電化學(xué)氧化法等)，以石墨、活性碳、碳納米管和納米金剛石作為碳源通過“自上而下”的方法剝離即可得到性能優(yōu)越的CDs[27-28]；用化學(xué)法以碳水化合物如有機(jī)酸鹽(檸檬酸鹽、焦磷酸鹽)或糖類(葡萄糖、殼聚糖、阿拉伯糖、醋酸纖維素)為碳源，通過“自下而上”的方法也可以制備滿足各種用途的CDs[23,29-33]。目前CDs的合成方法包括水熱法、微波法、溶劑熱法、超聲法，在這些合成方法中，水熱法和微波法因可制備出粒徑高度均勻的CDs，且設(shè)備簡單、合成可控、效率高、適合大規(guī)模生產(chǎn)，故應(yīng)用最廣泛[34-35]。近年來的研究顯示：相比于其它碳源，以天然產(chǎn)物為前體合成的CDs顯示出良好的發(fā)光穩(wěn)定性、低毒性、良好的生物相容性和高溶解性，且成本低，合成路徑綠色環(huán)保[36]。

以天然產(chǎn)物為原料合成CDs時(shí)多采用水熱法。Wang研究組將木瓜粉作為天然碳源，采用水熱法制備的水溶性CDs和乙醇可溶性CDs，均表現(xiàn)出良好的生物相容性，其量子產(chǎn)率(QY)分別達(dá)18.98%和18.39%，可作為熒光探針檢測Fe3+，檢測限分別為0.48 μmol·L-1和0.29 μmol·L-1[37]。Somasundaram等將香蕉植物假莖的汁液與乙醇混合，制備得到高熒光強(qiáng)度的CDs，其QY高達(dá)48%，并對Fe3+具有高選擇性，檢測限低至6.4 nmol·L-1[38]。Shen等以紅薯為碳源，通過水熱處理合成了無毒、分散性好、QY達(dá)8.64%的CDs，并成功應(yīng)用于活細(xì)胞中Fe3+的檢測[39]。以食用綠色植物西蘭花為碳源，一步水熱法合成CDs的方法簡單、綠色、成本低，在構(gòu)建高靈敏熒光探針檢測Ag+時(shí)，檢測限為0.5 mmol·L-1，有望作為免標(biāo)記Ag+檢測熒光探針用于環(huán)境水污染監(jiān)測[40]。除用常見植物作為碳源合成CDs外，Zhang等以寧夏的太原煤為碳源，采用硝酸氧化輔助水熱法合成發(fā)綠色熒光的CDs，并依據(jù)Fe3+可與CDs表面的酚羥基形成復(fù)合物的原理，設(shè)計(jì)基于CDs 的熒光探針檢測Fe3+，檢出限低至0.67 μmol·L-1[41]。Zhan等將3-氨丙基三甲氧基硅烷與戊二醛混合合成硅摻雜的CDs，其QY達(dá)13.60%，且基于Cu2+對硅摻雜CDs具有選擇性熒光猝滅作用，建立了水樣中Cu2+的分析檢測方法，該法操作簡單、選擇性好、靈敏度高[42]。水熱合成方法便捷、高效、綠色，顯著提高了CDs的合成效率，因此可更方便地合成高性能的CDs用于構(gòu)建功能化熒光探針。

相比于水熱法，采用微波法以天然產(chǎn)物為原料合成CDs的報(bào)道相對較少。用微波法處理蓮藕，可合成QY高達(dá)19.0%的氮摻雜碳點(diǎn)(N-CDs)。蓮藕切碎混合超純水?dāng)嚢瑁谖⒉t(800 W)中加熱6 min，然后將溶液離心，過濾并透析。合成的N-CDs可靈敏檢測Hg2+，檢測限低至18.7 nmol·L-1，該探針成功用于污水實(shí)際樣品的監(jiān)測[43]。Zhang等以草酸和尿素為混合碳源，微波法一步合成了氮摻雜的具有藍(lán)色熒光的CDs，并發(fā)現(xiàn)相比于單獨(dú)以草酸為碳源，用尿素進(jìn)行氮摻雜得到的CDs可獲得更高的QY，且該CDs具有良好的溫敏熒光響應(yīng)性質(zhì)，有望作為溫敏性光學(xué)納米探針在細(xì)胞研究領(lǐng)域得到應(yīng)用[44]。Wang等將天然無毒的羊毛清洗切成3～5 mm，與水混合后加入到微波消解罐中，200 ℃下加熱1 h，然后離心15 min，通過一步微波輔助熱解工藝制備了CDs。該合成方法簡單，且不含其它添加劑，制備的高性能CDs可應(yīng)用于構(gòu)建熒光探針檢測農(nóng)殘[45]。微波輔助合成法加熱均勻、功率可調(diào)、反應(yīng)時(shí)間短，因而極大地提高了CDs的合成效率。

2 碳點(diǎn)熒光探針的設(shè)計(jì)及其在農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用

隨著CDs合成方法及表面功能化修飾技術(shù)的不斷發(fā)展，其熒光量子產(chǎn)率、熒光壽命、水溶性及生物兼容性等性能也極大地提高，并廣泛用于熒光檢測[26]。目前已有許多研究基于碳點(diǎn)的復(fù)合材料設(shè)計(jì)熒光探針，如摻雜碳點(diǎn)熒光探針、分子印跡聚合物包埋碳點(diǎn)熒光探針及酶抑制型碳點(diǎn)熒光探針等，且已成功用于農(nóng)殘檢測。Larki等研究發(fā)現(xiàn)在殺螟硫磷存在下，CDs的熒光能明顯增強(qiáng)，并據(jù)此設(shè)計(jì)了基于CDs的熒光探針檢測殺螟硫磷[46]。Gao基于對硫磷可顯著增強(qiáng)CDs的熒光強(qiáng)度，設(shè)計(jì)了熒光增強(qiáng)型探針檢測對硫磷[47]。相反，Chang等基于對氧磷可猝滅CDs的熒光，設(shè)計(jì)了熒光猝滅型探針檢測蔬菜上的對氧磷[48]。

2.1 以摻雜碳點(diǎn)設(shè)計(jì)熒光探針用于農(nóng)藥檢測

Li等以離子液體巰基乙酸N-甲基乙醇銨為前體合成S、N共摻雜的CDs，通過雙酶級聯(lián)催化反應(yīng)引起該CDs的熒光猝滅，并以此構(gòu)建用于高靈敏檢測農(nóng)藥(西維因)的熒光探針，檢測限低至5 μg·L-1[58]。在該方法中，摻雜不僅增強(qiáng)了CDs熒光壽命，QY也由摻雜前的7%提高至12.5%，因此極大地提高了該熒光探針的檢測效率；另外，CDs摻雜后還可以提高檢測目標(biāo)的選擇性，如用S、N摻雜CDs設(shè)計(jì)熒光探針能顯著增強(qiáng)農(nóng)藥的選擇性。Zou等以L-半胱氨酸為C、N、S源，一步水熱法合成了N,S-CDs，并基于氟啶胺與N,S-CDs之間發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)猝滅N,S-CDs熒光的機(jī)理構(gòu)建了該目標(biāo)物的高靈敏檢測探針。該熒光探針可以成功用于土壤和蘋果等復(fù)雜實(shí)際樣品中氟啶胺的檢測[59]。元素?fù)诫s的策略在改善CDs光學(xué)性能的同時(shí)還可以進(jìn)一步改變其表面官能團(tuán)，使其更容易功能化或有利于檢測目標(biāo)的特異性識別。另外，目前報(bào)道的大多摻雜策略都是基于非金屬元素的摻雜，金屬元素?fù)诫s也能大大改善CDs的光學(xué)性能，因此金屬元素?fù)诫s的CDs構(gòu)建的高效熒光探針的研究也正受到越來越多研究者的關(guān)注。

2.2 分子印跡聚合物包埋碳點(diǎn)的熒光探針用于農(nóng)藥檢測

分子印跡聚合物(MIPs)是通過分子印跡技術(shù)合成對特定模板分子具有特異性識別能力和選擇性吸附的聚合物,通常稱為塑料抗體或仿生抗體[9]。MIPs作為受體或識別元件能通過特定設(shè)計(jì)的空腔對目標(biāo)分析物進(jìn)行識別[60]。通過MIPs包埋CDs設(shè)計(jì)熒光探針同時(shí)整合了MIPs的高選擇性作為目標(biāo)物的識別部件和CDs的發(fā)光性能作為信號輸出基團(tuán)，基于此可構(gòu)建對特定目標(biāo)分子識別并引起熒光傳感信號變化的一種功能復(fù)合物材料探針[61]。這些材料價(jià)格低，機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性高，且可重復(fù)使用，因此受到科研工作者的廣泛關(guān)注。

Ensafi等以橙汁為碳源通過水熱法制得CDs，以鹽酸異丙嗪(PrHy)為模板分子，環(huán)己烷為功能單體，通過反相微乳液法合成了碳點(diǎn)-分子印跡聚合物(CDs-MIPs)。CDs-MIPs的熒光強(qiáng)度與PrHy的濃度在2.0～250 μmol·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限為0.5 μmol·L-1。將該法用于實(shí)際樣品中PrHy的檢測，回收率為96.4%～102%[62]。因此，當(dāng)CDs和分子印跡技術(shù)的獨(dú)特性質(zhì)相結(jié)合時(shí)，熒光探針的選擇性得到極大提高，其應(yīng)用前景良好。另外，Liu及其團(tuán)隊(duì)以甘薯皮為碳源制備生物質(zhì)CDs，在功能單體和交聯(lián)劑的作用下通過溶膠-凝膠法合成聚合物，然后用乙醇和水洗去模板分子，得到CDs-MIPs。隨著目標(biāo)分子土霉素濃度的增加，CDs-MIPs的熒光強(qiáng)度逐漸降低。該熒光探針已成功用于蜂蜜中土霉素的檢測，回收率為90.2%～97.3%，檢出限為15.3 nmol·L-1[63]。同樣，Liu采用溶膠-凝膠法設(shè)計(jì)了氨基修飾的CDs-MIPs，通過苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥分子特異性結(jié)合聚合物的空腔引起檢測信號的變化，構(gòu)建高特異性定量檢測苯醚甲環(huán)唑的高效熒光探針，檢出限低至0.93 μg·mL-1[64]。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的機(jī)理，也可設(shè)計(jì)高靈敏度、高選擇性、方法便捷的農(nóng)殘檢測探針[65]。基于CDs和鍵合甲基紅染料的MIPs之間能產(chǎn)生FRET，Li研究團(tuán)隊(duì)在氧化銦錫電極上制備MIPs，開發(fā)了一種新型分子印跡熒光探針來檢測復(fù)雜樣品中的樂果，該方法靈敏度高、選擇性高、穩(wěn)定性好，檢出限低至0.018 nmol·L-1[25]。將CDs與量子點(diǎn)(QD)結(jié)合，Mohammad開發(fā)了一種雙發(fā)射介孔結(jié)構(gòu)分子印跡熒光探針比率檢測烯唑醇 (DNZ)。在該探針設(shè)計(jì)中，二氧化硅納米球包裹的藍(lán)色熒光CDs作為內(nèi)參信號，封裝在介孔二氧化硅孔洞里綠色熒光的QD作為響應(yīng)信號。DNZ選擇性地猝滅QD的熒光，同時(shí)伴隨著綠色到藍(lán)色的顏色變化，根據(jù)熒光信號的藍(lán)移和強(qiáng)度的變化，可以高靈敏檢測DNZ[66]。該CDs/QD熒光探針結(jié)合了分子印跡技術(shù)的高選擇性和比率測定的準(zhǔn)確性，另外MIP的介孔結(jié)構(gòu)有效地解決了常規(guī)MIP結(jié)合位點(diǎn)少、比表面積小的問題。將該熒光探針應(yīng)用于水和土壤樣品中DNZ的測定，獲得滿意的回收率。

MIPs包埋CDs的熒光探針在極大提高檢測目標(biāo)特異性的同時(shí)，也使探針的可修飾性大大提高，從而有利于構(gòu)建特定功能的高靈敏探針檢測農(nóng)殘。但MIP傳感器存在聚合物可能不規(guī)則，且模板分子可能永久性被捕獲導(dǎo)致目標(biāo)分子吸附性差的缺點(diǎn)。

2.3 酶抑制型碳點(diǎn)熒光探針用于農(nóng)藥檢測

酶抑制型碳點(diǎn)熒光探針廣泛用于農(nóng)藥的檢測。農(nóng)藥作為抑制劑，可抑制酶的活性或作為重要的底物直接參與酶催化反應(yīng)，間接影響熒光信號的強(qiáng)弱。酶的“Induced-Fit”關(guān)系使基于酶催化反應(yīng)的農(nóng)殘檢測方法具有較高靈敏度和良好的選擇性。如乙酰膽堿酯酶(AChE)、丁酰膽堿酯酶、胰蛋白酶、有機(jī)磷水解酶及酪氨酸酶等酶的應(yīng)用已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注[67]。AChE和丁酰膽堿酯酶在農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用較廣泛。在AChE抑制型熒光探針中，AChE可催化乙酰硫代膽堿生成含有化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)巰基的硫代膽堿(TCh)，該物質(zhì)可與金屬陽離子或熒光納米材料發(fā)生特異性反應(yīng)[68]。

3 總結(jié)與展望

碳點(diǎn)作為不含重金屬的熒光納米材料，其主要成分碳是構(gòu)成生命體的元素之一，具有熒光強(qiáng)度高、水溶性好、耐光漂白、低毒性、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)殘檢測方面得到了越來越廣泛的研究，具有極大的應(yīng)用潛力。然而，對碳點(diǎn)的研究利用仍處于初級探索階段，其結(jié)構(gòu)組成、熒光機(jī)理尚不十分明確。在合成制備方面，原料的選擇多樣且方法靈活簡便，但多數(shù)仍僅限于實(shí)驗(yàn)室合成，對其表面性能進(jìn)行后續(xù)純化處理通常比較繁瑣和耗時(shí)，且影響熒光量子產(chǎn)率。在食品安全檢測應(yīng)用方面，碳點(diǎn)構(gòu)建的熒光探針由于具有響應(yīng)速度快、價(jià)格低廉、無需大型儀器設(shè)備的特點(diǎn)，在該領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力；但在實(shí)際樣品分析時(shí)由于成分復(fù)雜，仍面臨許多挑戰(zhàn)；例如受共存干擾物的影響，檢測目標(biāo)的特異性不強(qiáng)，檢測的靈敏度也有待提高；另外目前報(bào)道的大多數(shù)方法檢測目標(biāo)單一，多組分同時(shí)檢測的報(bào)道非常少，需要進(jìn)一步的研究探索。因此，合成產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好、性能更優(yōu)越的碳點(diǎn)，通過尋找合適的原材料，并對合成方法進(jìn)行優(yōu)化，在降低成本的同時(shí)提高產(chǎn)率，是實(shí)現(xiàn)碳點(diǎn)大規(guī)模應(yīng)用的關(guān)鍵。在構(gòu)建碳點(diǎn)熒光探針方面，進(jìn)行功能化及與其它方法(酶生物傳感器、免疫分析、分子印跡聚合物、電化學(xué)傳感器等)深度聯(lián)合能進(jìn)一步拓寬應(yīng)用范圍，構(gòu)建靈敏度好、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)的熒光探針，是碳點(diǎn)熒光探針的重要發(fā)展方向，這些方面的努力有望為食品安全監(jiān)管提供有效的新技術(shù)和新方法。