兩種線栓法制作小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型的比較

王東亮 王冬 何天鵬 趙婧 高欣 袁媛

隨著人們生活水平的提高，高血糖、高血脂、高血壓已成為人類的常見(jiàn)疾病，由此導(dǎo)致的腦卒中患者的死亡率也逐年升高。據(jù)大數(shù)據(jù)顯示，腦卒中是我國(guó)致殘和致死的首要原因，目前腦卒中的治療已成為基礎(chǔ)和臨床工作者的主要研究方向和熱議話題[1]。為了更好的還原腦卒中的病理生理過(guò)程，在相應(yīng)的基礎(chǔ)研究中，如何準(zhǔn)確選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制作可行有效的病理模型就極為重要。

由于大腦中動(dòng)脈是引起腦卒中最為常見(jiàn)的閉塞部位，故大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的動(dòng)物模型被越來(lái)越多的科研工作者采納[2]。目前最經(jīng)典的缺血性腦損傷模型為線栓法制備的MCAO 模型[3]。1986 年Koizumi 等[4]首先報(bào)道了利用線栓法制備MCAO 模型，隨后Longa 等[5]于1989 年在此方法上做了改進(jìn)，現(xiàn)如今被廣泛應(yīng)用。目前常用的線栓途徑有兩種，頸總動(dòng)脈插線和改良Longa 法頸外動(dòng)脈插線，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈兩種途徑插線制備MCAO 模型，比較兩種方法所制作模型的優(yōu)劣，從而提高實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn)度和可重復(fù)性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)器材：顯微鑷、眼科剪、維納斯剪、止血鉗、自制拉鉤、微動(dòng)脈夾、小鼠固定器、縫合線（甘肅省人民醫(yī)院設(shè)備管理處）；小動(dòng)物麻醉機(jī)及異氟烷麻醉氣體（R520IE，R510-22-16）、臺(tái)式雙目體視顯微鏡（77001）、反饋式雙通道術(shù)中體溫維持系統(tǒng)（69020）（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；術(shù)后保溫箱（60 cm×40 cm×50 cm，上海玉研科學(xué)儀器有限公司），激光多普勒血流儀（潛流系統(tǒng)5000，Perimed，斯德哥爾摩，瑞典），線栓（6-0，L1800，廣州佳靈生物技術(shù)有限公司），激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8 STED 3X，Leica，德國(guó)）。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：異氟烷麻醉氣體（R510-22-16，深圳市瑞沃德生命科技有限公司），2,3,5-氯化三苯基四氮唑（T8877-25G，Sigma-Aldrich，美國(guó)），In Situ Cell Death Detection Kit，F(xiàn)luorescein（11684795910，Roche，德國(guó)），0.9%氯化鈉注射液（H12020010，中國(guó)大冢制藥有限公司）。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)C56BL/6 雄性小鼠42 只，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可SCXK（京）2016-0006；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可SYXK（甘）2015-0005。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）動(dòng)物分組

將42 只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=6）、頸外組（n=18）、頸總組（n=18）。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23℃±1℃），濕度（60%±5%），光照8:00～20:00，術(shù)前8 h 禁食禁水[6]。實(shí)驗(yàn)中有關(guān)動(dòng)物的操作均嚴(yán)格按照相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用規(guī)范，造模手術(shù)過(guò)程中盡量達(dá)到無(wú)菌操作，術(shù)中及術(shù)后蘇醒期間維持小鼠肛溫（37℃±0.5℃）[7]。

（二）模型的制備

1.麻醉：異氟烷誘導(dǎo)并吸入麻醉，頸部常規(guī)消毒備皮，采取頸部正中切口剪開(kāi)皮膚，用顯微鑷鈍性分離皮膚下肌肉層暴露頸動(dòng)脈鞘，仔細(xì)分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，注意避免觸碰頸動(dòng)脈鞘內(nèi)的迷走神經(jīng)。

2.頸總組模型制備：（1）頸總動(dòng)脈近心端6-0 絲線結(jié)扎；（2）頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端靠近分叉處6-0 絲線活結(jié)固定；（3）結(jié)扎頸外動(dòng)脈；（4）動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈；（5）在頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎線與固定線栓的活結(jié)之間用維納斯剪剪一小口，置入線栓，打開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈動(dòng)脈夾，兩手互相輔助操作使線栓沿頸內(nèi)方向進(jìn)入，固定線栓的結(jié)扎線勒緊；（6）再灌注時(shí)拔出線栓即可。具體信息見(jiàn)圖1A。

3.頸外組模型制備：（1）頸總動(dòng)脈6-0 絲線活結(jié)結(jié)扎固定；（2）頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)離分叉處6-0 絲線結(jié)扎；（3）頸外動(dòng)脈靠近分叉處6-0 絲線活結(jié)固定；（4）動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈；（5）頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)離分叉結(jié)扎線與固定線栓的活結(jié)之間用維納斯剪剪一小口，以遠(yuǎn)心至近心方向置入線栓，扎緊線栓固定結(jié)，電凝筆離斷頸外動(dòng)脈，調(diào)整線栓方向順時(shí)針調(diào)整120°左右，再由近心至遠(yuǎn)心方向插入頸內(nèi)動(dòng)脈；（6）打開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈動(dòng)脈夾，兩手互相輔助操作使線栓沿頸內(nèi)方向進(jìn)入，再次固定線栓的結(jié)扎線；（7）再灌注時(shí)拔出線栓，同時(shí)打開(kāi)同側(cè)頸總動(dòng)脈固定活結(jié)。具體信息見(jiàn)圖1B。

圖1 2 種插線途徑MCAO 模型示意圖

4.MCAO 模型制備要點(diǎn)：插線過(guò)程中調(diào)整血管方向避免線栓進(jìn)入翼顎動(dòng)脈；線栓進(jìn)入大腦中動(dòng)脈時(shí)會(huì)遇到輕微阻力，此時(shí)不宜再進(jìn)，這時(shí)線栓深度大約（1±0.2）cm，多普勒血流儀顯示中動(dòng)脈血流曲線約下降70%，剪斷多余暴露于血管外部的線栓。由于個(gè)體差異，有的小鼠不會(huì)遇到阻力，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將剔除這一類小鼠。清理手術(shù)視野，連續(xù)縫合切口。栓塞1 h 后拔出線栓得以再灌注，待動(dòng)物蘇醒后置于保溫箱（溫度設(shè)置27℃），自由流質(zhì)飲食。

5.假手術(shù)組模型制備：假手術(shù)組制備與上述相同，但不插入線栓。

（三）行為學(xué)評(píng)分

在動(dòng)物缺血1 h 后取出線栓，撤掉麻醉，動(dòng)物會(huì)自然蘇醒，再灌注24 h 后，進(jìn)行Longa 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，并將其作為動(dòng)物中風(fēng)嚴(yán)重程度、術(shù)后身體狀況的綜合判定依據(jù)。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：（1）0 分：沒(méi)有神經(jīng)功能損傷的癥狀，小鼠能夠正常活動(dòng)、進(jìn)食；（2）1分：將小鼠尾巴提起后，右前肢屈曲；（3）2 分：將小鼠放置于平板上，向右轉(zhuǎn)圈；（4）3 分：將小鼠放置平板上，用手推向右傾倒；（5）4 分：小鼠右側(cè)肢體偏癱，不能自發(fā)行走意識(shí)朦朧或喪失。2 分的小鼠模型最為成功、模型穩(wěn)定且術(shù)后狀態(tài)最佳。比較2 組術(shù)后評(píng)分為2 分（狀態(tài)良好）與非2 分（狀態(tài)不佳，包括死亡）的小鼠例數(shù)，比較2 種小鼠模型制備方法的效果。

（四）TTC 染色

MCAO 后24 h，20%烏拉坦5 mL/kg 麻醉小鼠，1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）心臟灌流后，快速取出全腦，迅速將其置于帶有碎冰渣的冰凍PBS 中5～10 min，去掉額極和枕極后切成2 mm 厚的冠狀切片5 塊，切片立即放入2%TTC 染液中在37℃、避光、水平搖床緩慢搖動(dòng)下孵育5 min，正常組織染色后呈鮮紅色，梗死區(qū)呈瓷白色；后將染色的腦片置于4%PFA 中固定、拍照。在imagePro plus 軟件中分析并計(jì)算梗死體積。為了消除腦水腫對(duì)梗死體積的影響：梗死體積=（正常側(cè)腦組織體積-梗死側(cè)正常腦組織體積）/正常側(cè)腦組織體積×100%[8]。

（五）腦含水量

TTC 染色后腦片，用濾紙吸水分后稱濕質(zhì)量，錫紙包裹放入70℃恒溫干燥箱中72 h，后稱干質(zhì)量。按照腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%[6]。

（六）TUNEL 神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

20%烏拉坦按5 mL/kg 麻醉大鼠，1×PBS 心臟灌流至心臟發(fā)白，后用4%多聚甲醛灌流至肢體僵硬。灌注完畢后開(kāi)顱撥腦殼，取bregma 點(diǎn)至lambda點(diǎn)之間的腦組織，置入4%多聚甲醛中固定24 h，后30%蔗糖溶液中脫水至組織下沉。OCT 包埋，冰凍切片機(jī)急速冷凍至樣品溫度-10℃，冠狀切片，片厚30 μm，粘于多聚賴氨酸處理后的正離子防脫玻片上，-80℃避光保存。冰凍玻片室溫解凍5～10 min，擦去玻片上殘余OCT，疏水免疫組織化學(xué)筆圈定組織范圍，至于避光免疫組織化學(xué)盒中。PBS 洗片3 次，每次5 min，0.3%TritonX-100 破膜10 min，后PBS 繼續(xù)洗片3 次，每次5 min。按每份材料5 μL TdT 酶、45 μL FITC 熒光液混合成50 μL TUNEL 染色液，37℃避光孵育2 h。PBS 洗片4 次，每次5 min，DAPI 染色液（5 μg/mL），按每份組織50 μL 染細(xì)胞核，10 min。PBS 洗片4 次，每次5 min，后用抗熒光淬滅封片劑封片，4℃保存，鏡檢。結(jié)果判定：激光共聚焦顯微鏡觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用prism8 軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用imageJv1.8.0 軟件處理圖像，其中小鼠存活情況以及神經(jīng)功能評(píng)分采用χ2檢驗(yàn)分析，梗死體積、腦水腫程度、神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、各組小鼠術(shù)后存活情況

缺血1 h 再灌注24 h 后對(duì)各組小鼠術(shù)后存活率進(jìn)行比較，頸外組術(shù)后存活率（100%）明顯高于頸總組（72.2%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 3 組模型小鼠存活率比較

二、各組小鼠longa 神經(jīng)功能評(píng)分比較

缺血1 h 再灌注24 h 后對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。比較術(shù)后評(píng)分為2 分（狀態(tài)良好）與非2分（狀態(tài)不佳，包括死亡）的小鼠例數(shù)，頸外組術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分為2 分的小鼠明顯多于頸總組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 3 組小鼠longa 神經(jīng)功能評(píng)分比較

三、TTC 染色梗死體積統(tǒng)計(jì)

頸外組與頸總組梗死體積接近，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.096、P=0.062，圖2）。

圖2 TTC 染色梗死體積統(tǒng)計(jì)

四、腦水腫程度比較

缺血1 h 再灌注24 h 后，與假手術(shù)組相比，頸外組腦組織水腫明顯（t=5.789，P=0.002），頸總組腦組織水腫明顯（t=5.983，P=0.002），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；頸外組與頸總組腦水腫程度相近，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.297，P=0.251）。具體信息見(jiàn)圖3。

圖3 3 組小鼠腦水腫程度比較

五、TUNEL 神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

在20×激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖4），sham組未見(jiàn)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞，頸總組和頸外組可見(jiàn)大量TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞。TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)面積取整數(shù)為1 mm2，頸外組的TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)即神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量（2505±45.12）與頸總組（2404±58.59）接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.199，圖5）。

圖4 TUNEL 神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況（20×）

討論

缺血性腦血管病約占臨床上腦血管病的80%，其中以大腦中動(dòng)脈栓塞最為常見(jiàn)[2,9]。因此，需要選擇穩(wěn)定性重復(fù)性好的動(dòng)物模型來(lái)模擬這一疾病的發(fā)生、發(fā)展、結(jié)局以及轉(zhuǎn)歸[10-12]。

圖5 TUNEL 細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖

MCAO 模型是目前被學(xué)術(shù)界所公認(rèn)的缺血性腦卒中模型，其出現(xiàn)為臨床缺血性腦損傷的理論研究提供了條件[13]。其中線栓法最為貼近臨床實(shí)際，且可以準(zhǔn)確控制栓子的位置、走向以及取栓時(shí)間，同時(shí)具有不開(kāi)顱、減少感染、梗死體積穩(wěn)定、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于腦血管病的研究[14]。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較兩種不同路徑的MCAO 線栓法的效果，可以看出頸外動(dòng)脈插線更具有優(yōu)勢(shì)以及研究?jī)r(jià)值。作為一個(gè)合格的手術(shù)模型必須具備穩(wěn)定性和可重復(fù)性，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析，兩種模型所制造的動(dòng)物行為的改變、梗死體積、腦水腫程度以及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡比較一致。但頸外動(dòng)脈插線的優(yōu)勢(shì)在于其保證模型穩(wěn)定的同時(shí)很大程度上提高了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活率，有利于對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期疾病發(fā)生過(guò)程的長(zhǎng)時(shí)間跟蹤觀察，也可滿足后續(xù)的藥物長(zhǎng)期干預(yù)治療。

研究分析表明，頸外動(dòng)脈插線實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率提高的原因大致有以下幾點(diǎn)。首先，在操作上，頸外動(dòng)脈插線能夠盡可能避免術(shù)中的出血以及減少手術(shù)引起的機(jī)械損傷，由于栓子不通過(guò)頸總動(dòng)脈以及頸總動(dòng)脈的結(jié)扎時(shí)間較短，可以很大程度上減少機(jī)械原因引起的血栓形成；電凝頸外動(dòng)脈也可以避免頸外動(dòng)脈在術(shù)中的出血。其次，頸外動(dòng)脈插線可以減少術(shù)后動(dòng)物的蘇醒時(shí)間，給動(dòng)物復(fù)蘇之后的存活提供更多的可能性。更為重要的是，頸外動(dòng)脈插線很大程度上保留了動(dòng)物原有的血管構(gòu)型，這一點(diǎn)在再灌注期表現(xiàn)更為明顯，其大腦中動(dòng)脈供血來(lái)源于原有的頸總動(dòng)脈以及WILLS 循環(huán)的對(duì)側(cè)的雙重血供，氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以得到充分供給[15,16]；而頸總動(dòng)脈插線致使頸總動(dòng)脈完全被破壞，大腦中動(dòng)脈血供只能來(lái)源于側(cè)支循環(huán)，這一情況等同于慢性反復(fù)缺血，再灌注后再缺血，對(duì)動(dòng)物造成二次傷害；頸外動(dòng)脈插線實(shí)現(xiàn)了術(shù)后頸總動(dòng)脈到頸內(nèi)動(dòng)脈這一貼合臨床實(shí)際的再灌注途徑。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)證明頸外動(dòng)脈插線制作MCAO模型更具有優(yōu)勢(shì)，值得推廣應(yīng)用。但該模型對(duì)術(shù)者經(jīng)驗(yàn)手術(shù)技巧要求非常高，因動(dòng)物個(gè)體間的差異線栓插入的深度不好掌控，術(shù)后護(hù)理溫度和濕度、術(shù)后小鼠補(bǔ)液營(yíng)養(yǎng)的維持同樣是不容小覷的細(xì)節(jié)管理。因此，MCAO 模型還需要在不斷實(shí)踐中進(jìn)行探索和改進(jìn)，使得其更加明晰地模擬人類腦缺血再灌注損傷，能夠更大程度地為探索和改進(jìn)缺血性腦損傷疾病的治療起到推動(dòng)作用。

綜上所述，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比分析，作為大腦中動(dòng)脈栓塞模型，頸外動(dòng)脈栓塞途徑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率更高，適合長(zhǎng)期觀察研究應(yīng)用，所以推薦采用頸外動(dòng)脈插線方法制作大腦中動(dòng)脈栓塞模型。