弓形蟲基因工程疫苗研究進(jìn)展

趙海忠　李良華　宋忠旭　孫華　彭先文　梅書棋

摘要：弓形蟲病是嚴(yán)重危害人和動物健康的重要人畜共患病。疫苗接種是目前防控弓形蟲病的主要手段。根據(jù)國內(nèi)外弓形蟲病研究的現(xiàn)狀，簡要介紹了弓形蟲基因結(jié)構(gòu)、主要編碼蛋白和相關(guān)基因工程疫苗的最新研究進(jìn)展，主要包括核酸疫苗、重組卡介苗、多肽疫苗、基因缺失苗等，最后對基因工程疫苗研究工作的繼續(xù)開展提出了建議。

關(guān)鍵詞：弓形蟲；基因；抗原蛋白；基因工程疫苗

中圖分類號：S852.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2019）04-0010-03

弓形蟲?。═oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma）所引起的人畜共患病。它廣泛寄生在人和動物的有核細(xì)胞內(nèi)。該病呈全球性分布和流行，孕婦、寵物喂養(yǎng)者、飼養(yǎng)員、屠宰人員及免疫功能低下者均為高危人群。據(jù)估計(jì)，全世界約有25%的人受感染，我國人群感染率約為5%～20%[1]。弓形蟲在家畜中主要感染豬，以高熱、呼吸困難、神經(jīng)癥狀以及繁殖障礙為特征。近年來，弓形蟲病在豬場發(fā)病率呈上升趨勢，死亡率高達(dá)60%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大經(jīng)濟(jì)損失[2]。因此，該病的防治工作十分重要，而疫苗免疫仍是預(yù)防該病的重要手段[3]。隨著近幾年對弓形蟲相關(guān)基因和抗原結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，弓形蟲基因工程疫苗的研發(fā)取得了重大進(jìn)展。本文主要對弓形蟲基因結(jié)構(gòu)與基因工程疫苗研究的最新進(jìn)展進(jìn)行闡述，以期為科研工作者更好地防治該病提供參考。

1 基因組結(jié)構(gòu)

弓形蟲DNA以線粒體DNA、染色體DNA和類質(zhì)共生體DNA三種形式存在。線粒體DNA為環(huán)形，長度為36 kb。有一段約10 kb的顛倒重復(fù)序列。它除了編碼與呼吸鏈相關(guān)蛋白外，還有可能參與編碼弓形蟲期轉(zhuǎn)換的有關(guān)物質(zhì)[4]。染色體DNA中G+C含量約為55%，沒有甲基化的堿基[5]。類質(zhì)共生體DNA也為環(huán)形，大小35 kb，是以其他真核生物類質(zhì)體DNA序列為探針，通過原位雜交而發(fā)現(xiàn)的序列[6]。研究發(fā)現(xiàn)，類質(zhì)共生體有綠藻原性，在漫長的進(jìn)化過程中才逐漸演變成細(xì)胞器，它可能編碼DNA依賴的RNA聚合酶亞單位β和β′核糖體RNA小亞單位[7]。

2 主要編碼蛋白與基因工程疫苗

2.1 P30蛋白抗原

P30基因?yàn)閱我豢截惢?，全長1 634 bp，不含有內(nèi)含子。P30突變導(dǎo)致蟲體結(jié)合細(xì)胞能力顯著下降，在黏附宿主細(xì)胞膜過程中起著配體作用，在原核、真核和昆蟲細(xì)胞中均能表達(dá)出融合和非融合形式的重組蛋白[8]。P30表達(dá)產(chǎn)物的抗原活性與蛋白分子的折疊存在密切相關(guān)[9]，分子構(gòu)象高度決定其抗原性。易艷軍[10]構(gòu)建了弓形蟲P30基因的乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒L2Ps-P30-T，并在乳酸乳球菌中表達(dá)P30基因，表達(dá)產(chǎn)物口服免疫小鼠，結(jié)果表明在體液免疫、黏膜免疫水平上誘導(dǎo)小鼠對弓形蟲感染具有保護(hù)力。魏慶寬等[11]擴(kuò)增HBsAg目的基因片段，并將HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表達(dá)載體中，構(gòu)建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表達(dá)載體，該載體包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列，為進(jìn)一步研究多基因核酸疫苗奠定了基礎(chǔ)。

2.2 P22蛋白抗原

P22蛋白抗原是第2個被克隆和測序的弓形蟲表面抗原。速殖子入侵的過程由P22介導(dǎo)，錨定于有核細(xì)胞表面，并進(jìn)入有核細(xì)胞內(nèi)部[12]?？筆22蛋白抗體可以阻斷弓形蟲的再定位。P22蛋白除介導(dǎo)弓形蟲速殖子的入侵過程外，在弓形蟲速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮作用。趙東岳等[13]將去掉信號肽和C-末端的基因片段插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-3后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，采用誘導(dǎo)進(jìn)行可溶性表達(dá)。重組蛋白具有良好的完全抗原活性，這也為弓形蟲的基因重組疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。全娟花等[14]將弓形蟲SAG2基因插入pCMV-Taq2B載體，使其在真核細(xì)胞中高水平穩(wěn)定表達(dá)，構(gòu)建含pCMV-Taq2B-Surface antigen 2（表面膜抗原2）成分的核酸疫苗，結(jié)果表明，免疫組能產(chǎn)生特異性IgG抗體，末次免疫后28 d達(dá)到峰值。

2.3 P43蛋白抗原

P43蛋白抗原存在于弓形蟲所有入侵階段的膜蛋白。未成熟的P43蛋白由385個氨基酸殘基組成，含有一個N端信號肽和GPI。P43蛋白是參與弓形蟲入侵宿主細(xì)胞過程的主要分子，介導(dǎo)對宿主細(xì)胞的識別和黏附[15]。朱剛[16]以RH株弓形蟲P43蛋白為抗原分子，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，并以兔抗P43蛋白血清檢測到該基因所表達(dá)蛋白具有免疫原性。對小鼠肌注后，檢測小鼠產(chǎn)生了細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，此DNA疫苗對小鼠感染弓形蟲具有一定的免疫保護(hù)。

2.4 P35蛋白抗原

張仁利等[17]成功地進(jìn)行了弓形蟲P35蛋白的基因克隆，對P35蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其C端區(qū)有高親水性區(qū)域在201～225和301～340氨基酸處，同時也發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列含有多個T、B細(xì)胞的表位，P35蛋白可以產(chǎn)生部分的免疫保護(hù)力。易俊波等[18]則采用弓形蟲RH株表面抗原P35的cDNA序列設(shè)計(jì)一對引物，擴(kuò)增出P35的基因片段，并將其克隆到T載體中。亞克隆至原核表達(dá)載體pET-KDO后，在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到了具有良好抗原性的重組P35融合蛋白。

2.5 P23蛋白抗原

P23抗原為毒力相關(guān)抗原，位于速殖子表膜。該抗原僅見于RH株和BK株等強(qiáng)毒株，臨床分離的弱毒株未發(fā)現(xiàn)[19]。研究人員在研究弓形蟲疫苗的過程中發(fā)現(xiàn)了一種24 ku的多肽，該多肽能產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)性，能阻止弓形蟲速殖子入侵宿主細(xì)胞。該多肽基因表達(dá)產(chǎn)物能在動物體內(nèi)產(chǎn)生抗P23抗體，表明P23蛋白可能包含有該多肽的免疫表位。P23蛋白有望成為研發(fā)新型基因工程疫苗的重要抗原。

2.6 棒狀體蛋白

2.6.1 棒狀體蛋白1 棒狀體蛋白1基因是一個單拷貝基因，全長約為2.1 kb，蛋白分子質(zhì)量約60.5 kDa，其N端為富含脯氨酸的酸性結(jié)構(gòu)域，后面則是堿性羧基末端區(qū)域。用抗棒狀體蛋白1基因的單抗處理后，弓形蟲對宿主細(xì)胞的黏附受到抑制。棒狀體蛋白1基因盡管能誘導(dǎo)機(jī)體系統(tǒng)和黏膜局部體液免疫應(yīng)答，但并不能產(chǎn)生明顯的免疫保護(hù)[20]。

2.6.2 棒狀體蛋白2 棒狀體蛋白2是弓形蟲棒狀體分泌的另一個重要蛋白，基因全長2 234 bp，不含內(nèi)含子，未成熟的前體蛋白約66 kDa，成熟的棒狀體蛋白2約為54 kDa。該蛋白參與弓形蟲侵入后納蟲泡膜的形成，在弓形蟲生活史的速殖子期、緩殖子期以及子孢子期均有表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)棒狀體蛋白2的氨基端存在一系列的兩親性螺旋，單一的螺旋就能黏附于細(xì)胞膜上，共同作用則優(yōu)先黏附于新形成的納蟲泡膜。肖婷等[21]構(gòu)建了pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并正確表達(dá)融合蛋白，該融合蛋白能被弓形蟲P30單抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清識別，具有免疫反應(yīng)性，為乙肝和弓形蟲聯(lián)合疫苗的研制奠定了良好基礎(chǔ)。

2.7 微線體蛋白

2.7.1 微線體蛋白2（MIC2） 微線體蛋白2基因是單拷貝基因，有3個內(nèi)含子，全長2 307 bp，編碼含769個氨基酸殘基，且698～718位氨基酸殘基間存在一個短的疏水信號肽，為典型的跨膜區(qū)。TgMIC2在蟲體的各期均有表達(dá)，TgMIC2和TgM2AP以1∶1的比例形成一個包含3個aB二聚體六聚體復(fù)合體。鄭斌等[22]采用定點(diǎn)突變技術(shù)，準(zhǔn)確找到了MIC2與醛縮酶的作用位點(diǎn)為色氨酸（W）。而有關(guān)研究表明MIC2蛋白是弓形蟲感染的主要毒力因素，因而構(gòu)建MIC2缺陷株是開發(fā)有效活弱毒疫苗的重要方法[23]。

2.7.2 微線體蛋白3（MIC3） 微線體蛋白3基因無內(nèi)含子，ORF編碼一個富含半胱氨酸的395個氨基酸殘基多肽，N 端有一較短的疏水信號肽，無跨膜區(qū)域氨基酸序列中含5個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域，其中3個串聯(lián)排列，而另2個則與前3個有重疊，具有一個幾丁質(zhì)連接樣結(jié)構(gòu)域，這種序列能跟宿主蛋白一樣參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互識別作用。MIC3在弓形蟲的各期都能表達(dá)，為該病診斷和疫苗研制非常有前景的候選分子[24]。唐菲等[25]原核表達(dá)了弓形蟲RH株MIC3重組蛋白，并檢測了該重組蛋白特異免疫反應(yīng)性，這為利用該蛋白進(jìn)行弓形蟲病診斷與疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

2.8 致密顆粒蛋白

2.8.1 致密顆粒蛋白1（GRA1） 致密顆粒蛋白1分子質(zhì)量為23 kDa，含有2個鈣結(jié)合域，通過調(diào)節(jié)鈣離子濃度來穩(wěn)定納蟲泡膜。劉慧穎等[26]通過構(gòu)建致密顆粒蛋白GRA1基因真核重組表達(dá)質(zhì)粒，在Hela細(xì)胞中表達(dá)GRA1蛋白。經(jīng)檢測，GRA1蛋白具有良好的反應(yīng)原性。構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒制成的核酸疫苗，在小鼠攻毒試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)性，為該類疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2.8.2 致密顆粒蛋白2（GRA2） 致密顆粒蛋白2含一個長241 bp的內(nèi)含子，長約1.3 kb，初級翻譯產(chǎn)物為一個185個氨基酸的多肽，含有23個氨基酸長的信號肽，富含絲氨酸和蘇氨酸。GRA2依賴3個兩性a螺旋，在弓形蟲侵入后起著誘導(dǎo)納蟲泡膜表面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的作用。研究人員利用重組蛋白和佐劑單磷酰脂質(zhì)免疫小鼠后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生高比例的IgG2a/IgG1特異性抗體，脾細(xì)胞體外經(jīng)分泌-排泄抗原刺激后產(chǎn)生大量的IFN-γ和IL-2。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明該重組蛋白能有效抵抗弓形蟲慢性感染[27]。

2.8.3 致密顆粒蛋白3（GRA3） 致密顆粒蛋白3分子質(zhì)量為30 kDa，存在于內(nèi)管網(wǎng)和納蟲泡膜。為單拷貝基因，其cDNA序列N端有2個起始密碼子，開放閱讀框含有一個22個氨基酸的疏水區(qū)和一個信號肽。沈繼龍等[28]研究表明，GRA3無有效的3D結(jié)構(gòu)，抗原表位少，不宜作為弓形蟲有效疫苗候選分子。

3 展望

弓形蟲基因工程疫苗的研制方向：對弓形蟲與宿主之間的關(guān)系作深入研究，特別是針對弓形蟲各期所共有的保護(hù)性抗原及保護(hù)性表位的鑒定，繼續(xù)深入研究P30基因核酸疫苗、P22蛋白重組疫苗、P43蛋白重組疫苗、P23蛋白多肽疫苗、微線體蛋白2基因缺失苗等，在實(shí)用性、安全性及有效性方面顯示出強(qiáng)大的潛力。尋找更佳的免疫佐劑、優(yōu)化免疫程序，提高基因工程疫苗的實(shí)用效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] MEHLHORN H. Toxoplasma gondii[A].Encyclopedia of Parasitology[M].Berlin heidelberg：Springer，2015.

[2] 馮艷彬.豬弓形蟲病的流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)室診斷與防治[J].現(xiàn)代畜牧科技，2018（11）：80.

[3] 張 越，王華琳，丁瑩瑩，等.我國人群和某些動物弓形蟲感染研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2018，39（10）：96-101.

[4] 徐 婷，王 聰，羅慶禮，等.流行于我國的優(yōu)勢基因型弓形蟲株毒力及其棒狀體蛋白ROP5和ROP18蛋白序列差異分析[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018（11）：1695-1699.

[5] COUTERMARSH-OTT S L，ALLEN I C，LINDSAY D S，et al. Caspase-11 modulates inflammation and attenuates Toxoplasma gondii pathogenesis[J].Mediators of inflammation，2016（9）：1-14.

[6] REIFF S B，VAISHNAVA S，STRIEPEN B. The HU protein is important for apicoplast genome maintenance and inheritance in Toxoplasma gondii[J].Eukaryot cell，2012，11（7）：905-915.

[7] CARMELO A A，ELENA S S. Checkpoints of apicomplexan cell division identified in Toxoplasma gondii[J].Plos pathogens，2017， 13（7）：e1006483.

[8] REZAEI A A，GOLCHIN M，NAKHAEI MOGHADAM M. Detection of Toxoplasma gondii in infected meat samples by a latex agglutination test using anti-P30 recombinant antibody[J].Comparative clinical pathology，2019，28（1）：29-32.

[9] ABDULLAH W O，UNYAH N Z，AWANG HAMAT R，et al. Determination of diagnostic value of Toxoplasma gondii recombinant surface antigen（SAG1，P30） in mouse experimental model[J].Malaysian journal of veterinary research，2014，5（1）：83-88.

[10] 易艷軍.弓形蟲P30蛋白在乳酸乳球菌中的表達(dá)及其誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的研究[D].湖南衡陽：南華大學(xué)，2013.

[11] 魏慶寬，王英婷，閆運(yùn)琴，等.pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J].中國血吸蟲病防治雜志，2014，26（1）：46-50.

[12] PERETTI L E，GONZALEZ VER？魷NICA D G，COSTA J G，et al. Synthesis and characterization of latex-protein complexes from different antigens of Toxoplasma gondii for immunoagglutination assays[J].International journal of polymeric materials and polymeric biomaterials，2016，65（18）：938-946.

[13] 趙東岳，陳金鋒，韋劍輝.弓形蟲截短SAG2基因的克隆表達(dá)與免疫活性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2015，46（12）：2258-2263.

[14] 全娟花，李 鵬，喻才元，等.弓形蟲SAG2和GRA2基因疫苗的免疫保護(hù)研究[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報，2014，21（4）：227-232.

[15] 何 成.弓形蟲感染宿主細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析及宿主細(xì)胞蛋白vimentin在弓形蟲感染過程中的作用機(jī)制研究[D].廣東廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2018.

[16] 朱 剛.弓形蟲pSMART2b-SAG3 DNA疫苗的研制及其初步應(yīng)用[D].長春：吉林大學(xué)，2017.

[17] 張仁利，吳少庭，高世同，等.弓形蟲P35蛋白的基因克隆及其分子特征[J].中國人獸共患病雜志，2001，17（4）：24-26.

[18] 易俊波，王曉紅，買制剛，等.弓形蟲表面抗原P35基因片段的表達(dá)純化和抗原性分析[J].中國血吸蟲病防治雜志，2012，24（2）：178-182.

[19] GROSS U，BOHNE W，L？譈DER CARSTEN G K.，et al. Regulation of developmental differentiation in the protozoan parasite Toxoplasma gondii[J].Journal of eukaryotic microbiology，2010， 43（5）：114S-116S.

[20] NABI H，RASHID I，AHMAD N，et al. Induction of specific humoral immune response in mice immunized with ROP18 nanospheres from Toxoplasma gondii[J].Parasitology research，2016，116（1）：1-12.

[21] 肖 婷，毛德華，李 瑾，等.pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在293T細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國病原生物學(xué)雜志，2018，13（10）：1109-1112，1120.

[22] 鄭 斌，尹志奎，姚志軍，等. 剛地弓形蟲MIC2與醛縮酶作用位點(diǎn)的鑒定[J].中國人獸共患病學(xué)報，2014，30（7）：698-700.

[23] MY-HANG H，BING L，MAUD H，et al. Structural basis of Toxoplasma gondii MIC2-associated protein interaction with MIC2[J].Journal of biological chemistry，2015，290（3）：1432-1441.

[24] GU？魪RIN A，HAJJ H E，PENARETE-VARGAS D，et al. RON4L1 is a new member of the moving junction complex in Toxoplasma gondii[J].Scientific reports，2017，7（1）：17907.

[25] 唐 菲，韓思琪，吳 焜，等.弓形蟲RH株微線體蛋白MIC3的原核表達(dá)及其免疫反應(yīng)性[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2013，13（7）：786-789.

[26] 劉慧穎，孫 玲，李淑紅，等.弓形蟲GRA1基因核酸疫苗的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國病原生物學(xué)雜志，2012（3）：181-185.

[27] CAO A，LIU Y，WANG J，et al. Toxoplasma gondii：Vaccination with a DNA vaccine encoding T-and B-cell epitopes of SAG1，GRA2，GRA7 and ROP16 elicits protection against acute toxoplasmosis in mice.[J].Vaccine，2015，33（48）：6757-6762.

[28] 沈繼龍，陳 鶴，羅慶禮，等.基于生物信息學(xué)分析的弓形蟲GRA3的疫苗設(shè)計(jì)與體內(nèi)驗(yàn)證[A].中華醫(yī)學(xué)會2014全國微生物學(xué)與免疫學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C].北京：中華醫(yī)學(xué)會、中華醫(yī)學(xué)會微生物學(xué)與免疫學(xué)分會，2014.