百草枯核酸適配體的篩選及其比色檢測(cè)研究

冉旭東 吳遠(yuǎn)根

摘 要 核酸適配體具有類(lèi)似蛋白抗體的性質(zhì)，在靶標(biāo)特異性識(shí)別與檢測(cè)中引起越來(lái)越廣泛的關(guān)注。小分子物質(zhì)通常與環(huán)境污染和人類(lèi)健康密切相關(guān)，然而小分子物質(zhì)與核酸文庫(kù)在性質(zhì)上差異較小，在篩選過(guò)程中沒(méi)有足夠的活性位點(diǎn)，難以固定，因而其核酸適配體篩選難度更大。本研究采用體外合成一條生物素修飾的堿基序列，通過(guò)氫鍵與隨機(jī)文庫(kù)3′-末端進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，將其固定在鏈霉親和素修飾的納米磁珠上。隨后，加入不同濃度的百草枯靶分子孵育，洗脫得到百草枯特異性的親和性ssDNA，對(duì)其進(jìn)行非對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增后，得到下一輪篩選所需的富集ssDNA庫(kù)。經(jīng)過(guò)9輪篩選后，將所得親和性ssDNA進(jìn)行克隆測(cè)序，最終得到15條百草枯的親和ssDNA序列。對(duì)親和性序列進(jìn)行聚類(lèi)分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，再根據(jù)同源性等條件從中篩選出6條ssDNA序列進(jìn)行親和力測(cè)定。結(jié)果表明，PQ-15序列對(duì)百草枯的親和力最高，解離常數(shù)（Kd）為（54±4） nmol/L。最后，利用PQ-15核酸適配體作為百草枯的識(shí)別分子，以陽(yáng)離子化合物聚集的納米金作為傳感信號(hào)，建立了基于核酸適配體識(shí)別的百草枯農(nóng)藥比色檢測(cè)方法，檢出限為25.2 nmol/L，其它競(jìng)爭(zhēng)性分子對(duì)百草枯檢測(cè)無(wú)明顯干擾，實(shí)際樣品中百草枯的加標(biāo)回收率為91.1%～99.6%。

關(guān)鍵詞 核酸適配體; 百草枯; 篩選; 比色檢測(cè); 納米金

1 引 言

百草枯（1，1-二甲基-4，4-二吡啶二氯）是一種具有雙苯環(huán)結(jié)構(gòu)、極性很強(qiáng)的有機(jī)小分子，是毒性最強(qiáng)的除草劑之一，在水中溶解度極高[1]。由于生產(chǎn)成本較低、除草效率高，因而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，曾在一些發(fā)展中國(guó)家廣泛使用[2]。百草枯在食品中最大殘留限量為0.05 mg/kg[3]，其毒性與二價(jià)陽(yáng)離子還原及自由基有關(guān)，可引起細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，從而對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康造成潛在的威脅[4]。目前，由于缺乏特定的解毒劑和有效的治療方法，已有數(shù)萬(wàn)例因百草枯中毒死亡病例報(bào)告。我國(guó)自2014年7月1日起撤銷(xiāo)了百草枯水劑登記和生產(chǎn)許可，2016年7月1日全面停止水劑銷(xiāo)售和使用，但仍有一些固體藥物生產(chǎn)和非法使用。所以， 百草枯的檢測(cè)方法與治療方法的研究對(duì)保護(hù)消費(fèi)者健康具有重要意義。

核酸適配體是指具有10～100個(gè)堿基和特定復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的單寡鏈核苷酸，1990年由Szostak[5]和Gold[6]等通過(guò)指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 技術(shù)篩選獲得。核酸適配體與靶標(biāo)能發(fā)生特異性結(jié)合，親和力極高，其結(jié)合解離常數(shù)通?？梢赃_(dá)到納摩爾和皮摩爾級(jí)[7]。小分子有害污染物與人類(lèi)健康密切相關(guān)，但針對(duì)小分子靶標(biāo)的核酸適配體篩選方法還存在許多不足，如受到靶標(biāo)分子量以及材料特性制約，篩選平臺(tái)自動(dòng)化程度不高、隨機(jī)性較大，針對(duì)不同的靶標(biāo)需不同的篩選策略。通常，核酸適配體篩選成功與否主要取決于靶標(biāo)與ssDNA孵育結(jié)合及后續(xù)的分離純化[8]。研究人員建立了一些新的篩選技術(shù)，如毛細(xì)管電泳（CE）[9]、流式細(xì)胞儀（FC）[10]、表面等離子體共振（SPR）[11]、磁珠分離法[12] 、微流控篩選法[13]、氧化石墨烯[14]等，主要對(duì)SELEX程序進(jìn)行了改進(jìn)，以便快速、簡(jiǎn)單地篩選與各種靶標(biāo)及其類(lèi)似物結(jié)合的核酸適配體[15]。隨著近些年來(lái)核酸適配體篩選技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員已經(jīng)篩選出針對(duì)生物毒素、重金屬、抗生素、農(nóng)藥等小分子的核酸適配體，其中農(nóng)藥類(lèi)核酸適配體主要有啶蟲(chóng)脒[16]、莠去津[17]、甲拌磷、水胺硫磷、氧化樂(lè)果[18]、苯噻草胺、戊唑醇、抗倒胺[14]、氟蟲(chóng)腈[19]，但針對(duì)百草枯核酸適配體的篩選及檢測(cè)目前還未見(jiàn)報(bào)道。針對(duì)百草枯的檢測(cè)方法主要有免疫分析法[20]、高效液相色譜法[21]、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[22]、高效毛細(xì)管電泳法[23]等。這些檢測(cè)方法使用儀器價(jià)格昂貴，樣品前處理繁雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且需要專(zhuān)門(mén)的操作人員，不利于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)，所以有必要建立一種百草枯快速靈敏的檢測(cè)方法。

本研究在課題組前期報(bào)道的篩選方法[8]基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，采用磁分離技術(shù)對(duì)親和性ssDNA序列有效分離，采用非對(duì)稱(chēng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)9輪篩選后，成功獲得15條百草枯的親和ssDNA序列，并通過(guò)一系列測(cè)定，從中挑選出親和力最強(qiáng)的序列作為識(shí)別分子，建立了一種基于核酸適配體和陽(yáng)離子聚合物聚集納米金比色技術(shù)的百草枯快速檢測(cè)方法。此檢測(cè)方法具有快速、可裸眼辨別、靈敏度高、成本低且易操作的優(yōu)勢(shì)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

PTC-200型PCR儀（美國(guó)MJ RESEARCH公司）; PowerPa伯樂(lè)小型電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）; Milli-Q plus型恒溫孵育器（Millipore Inc， Bedford， MA）; 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）; 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）。

隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫(kù)5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3′、PCR引物P1（5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3′）、P2（5′-CGCAACGCTCGCTCATACT-3′）、生物素標(biāo)記的寡聚核苷酸序列P3（5′-Biotin-CGCAACGCTCGC-3′）、寡聚核苷酸純化試劑盒、非變性電泳凝膠試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、Marker、純化回收試劑盒和5×TBE（上海生工生物工程股份有限公司）; 鏈霉親和素磁珠（南京先豐納米材料科技有限公司）; 雙丙烯酰胺（Bis）、丙烯酰胺（Acr）、過(guò)硫酸銨、異丙醇、溴酚藍(lán)、AgNO3、甲醛溶液、百草枯標(biāo)準(zhǔn)液（濃度為100 μg/mL）、檸檬酸三鈉、氯金酸（HAuCl4）、聚二烯二甲基氯化銨（PDDA）、3-（N-嗎啡啉）丙磺酸（MPOS）等（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; NaCl、Tris·HCl、KCl、MgCl2·6（H2O）、CaCl2 、Tween-20和甘油等化學(xué)試劑均為市售分析純，購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司; 實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 核酸適配體的體外篩選步驟 百草枯核酸適配體的篩選步驟：（1） 隨機(jī)ssDNA的固定 取3 nmol的隨機(jī)ssDNA庫(kù)，按摩爾比1∶2與P3序列混合，95℃退火5 min，30℃孵育60 min，使隨機(jī)文庫(kù)的3'端12個(gè)堿基序列與P3通過(guò)氫鍵互補(bǔ)配對(duì)。將配對(duì)后的混合液移入裝有磁珠的離心管中，30℃孵育60 min， 由于磁珠表面接有鏈霉親和素，通過(guò)生物素-親和素作用，將隨機(jī)文庫(kù)固定在磁珠上。用Binding 緩沖液（BB， 100 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris-HCl， 5 mmol/L KCl， 2 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L CaCl2， 0.02% Tween-20，pH=7.4）洗滌，除去未固定的隨機(jī)文庫(kù)和P3。（2）ssDNA序列的洗脫 在第1輪篩選時(shí)，取終濃度為500 μmol/L的百草枯溶液加入到固定隨機(jī)文庫(kù)的磁珠中。為了使靶標(biāo)百草枯與固定的隨機(jī)文庫(kù)充分作用，進(jìn)一步提高適配體篩選成功率，根據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將百草枯農(nóng)藥與固定的隨機(jī)序列輕微振蕩5 min混勻，30℃孵育60 min后，于4℃過(guò)夜孵育。將上述磁珠用磁鐵充分分離，收集百草枯洗脫的ssDNA上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，計(jì)算洗脫率。在后續(xù)的SELEX篩選過(guò)程中，百草枯終濃度由500 μmol/L逐漸減少至50 μmol/L，其它操作與第1輪均相同。（3）非對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增 利用本課題組前期優(yōu)化的非對(duì)稱(chēng)PCR程序，擴(kuò)增百草枯洗脫的親和性序列。反應(yīng)溶液體系按照下述配方配制。PCR擴(kuò)增反應(yīng)液500 μL，包含200 μL模板鏈（即百草枯親和性ssDNA序列）、37.5 μL 10 μmol/L P1引物、7.5 μL 1 μmol/L P2引物和250 μL 2X PCR Master，將上述反應(yīng)液用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)加至500 μL，混合均勻后，等量分裝到10個(gè)PCR管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。非對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增條件為： 94℃，3 min （變性）; 20個(gè)快速三階段PCR循環(huán)（94℃，45 s; 51℃，30 s; 72℃，20 s）; 在72℃延伸反應(yīng)5 min。（4）凝膠電泳分離和ssDNA純化回收 經(jīng)非對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增后，取每輪的擴(kuò)增產(chǎn)物9 μL，各加入1 μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，1×TBE作為電泳緩沖液，用16%的非變性PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，電壓控制在100～120 V。電泳結(jié)束后， PAGE膠銀染。在下一輪百草枯核酸適配體篩選實(shí)驗(yàn)前，利用寡聚核苷酸純化試劑盒對(duì)本輪得到的PCR擴(kuò)增液進(jìn)行純化。

2.2.2 百草枯核酸適配體克隆測(cè)序及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 經(jīng)過(guò)9輪的SELEX篩選，對(duì)最后收集到的百草枯親和性序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增反應(yīng)液送到上海生工生物股份有限公司進(jìn)行純化和克隆測(cè)序。所有測(cè)序的序列用MEGA（Molecular evolutionary genetics analysis）軟件制作發(fā)育樹(shù)，二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)http：//mfold.rna.albany.edu/網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.2.3 核酸適配體解離常數(shù)（Kd）的測(cè)定 根據(jù)同源性及二級(jí)結(jié)構(gòu)等綜合分析，選出一些百草枯親和序列進(jìn)行FAM熒光標(biāo)記。然后分別配制10 μmol/L的適配體親和序列與20 μmol/L生物素標(biāo)記的P3序列，按照摩爾比1∶2混勻、變性后，60℃孵育60 min。用250 μL BB緩沖液洗滌磁珠3次，用200 μL BB緩沖液重懸磁珠，備用。將親和序列替代隨機(jī)文庫(kù)作為對(duì)照，取重懸的磁珠分別與P3和適配體親和序列雜交溶液進(jìn)行混合孵育120 min。用BB緩沖液洗滌除去未固定的親和序列和P3，總體積控制在1500 μL。測(cè)定收集洗脫液的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算親和序列的固定量（X）。將上述固定有親和序列的磁珠分散到適量BB溶液中，取終濃度為100 μmol/L靶標(biāo)溶液，與固定了百草枯親和序列的磁珠在60℃孵育120 min， 4℃過(guò)夜孵育，洗脫。取200 μL上清液，放入黑色酶標(biāo)板中，測(cè)定洗脫液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算得到與百草枯結(jié)合并被洗脫下的親和序列濃度（Y）。通過(guò)Origin8.0軟件進(jìn)行曲線擬合，擬合公式為 Y=BmaxX/（Kd+X）， 其中，Y為核酸與靶標(biāo)的復(fù)合物濃度; X為固定的核酸濃度; Bmax為常數(shù); Kd為解離常數(shù)（親和系數(shù)）。

2.2.4 AuNPs比色法檢測(cè)百草枯 （1）納米金的制備 利用“檸檬酸三鈉還原氯金酸法”制備納米金[24]。稱(chēng)取 33.98 mg HAuCl4·xH2O 和114.11 mg 二水檸檬酸三鈉，分別溶解在100 和10 mL雙蒸水中。加熱氯金酸溶液至沸騰，在劇烈攪拌過(guò)程中迅速加入10 mL的檸檬酸三鈉溶液，保持加熱15 min，溶液由淡灰色變成藍(lán)色，再漸變?yōu)樽仙敝磷優(yōu)榉€(wěn)定的酒紅色后，停止加熱。持續(xù)攪拌15 min，冷卻至室溫。將上述溶液用250 nm孔徑的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，濾液于棕色瓶中在4℃儲(chǔ)存，備用。（2） 基于AuNPs比色檢測(cè)百草枯 選取親和性最高的序列作為百草枯的識(shí)別分子，參照課題組前期建立檢測(cè)方法[25]，以陽(yáng)離子化合物聚集納米金為傳感信號(hào)，比色檢測(cè)百草枯。在整個(gè)傳感體系中，PDDA和適配體濃度對(duì)納米金聚集具有調(diào)控作用，因此需對(duì)體系中的PDDA和適配體用量進(jìn)行優(yōu)化。分散態(tài)的納米金在520 nm有最大吸收峰，聚集時(shí)在650 nm有最大吸收峰，因此取200 μL反應(yīng)液放入96孔板中用酶標(biāo)儀，測(cè)定吸光值A(chǔ)520 nm和A650 nm，以A650/520表示納米金聚集程度，靶標(biāo)與空白組A650/520的差值△A650/520作為檢測(cè)信號(hào)。（3）百草枯核酸適配體的性能分析 將親和性最強(qiáng)的序列與不同濃度的百草枯孵育，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行靈敏度測(cè)定。隨后選取甲拌磷、啶蟲(chóng)脒、敵敵畏、辛硫磷、丙溴磷、甲基對(duì)硫磷作為競(jìng)爭(zhēng)性靶標(biāo)，驗(yàn)證本方法對(duì)百草枯檢測(cè)的特異性，對(duì)比各自顏色變化情況，記錄各類(lèi)靶標(biāo)與空白平行組溶液的吸光差值△A650/520。采集貴州大學(xué)閱湖水（北緯26°26′47″， 東經(jīng)106°39′24″）作為樣品一，稻田水（北緯26°26′55″， 東經(jīng)106°41′16″）為樣品二，果蔬地土壤（北緯26°26′49″， 東經(jīng)106°39′45″）為樣品三，在上述實(shí)際樣品中分別加入500和1000 nmol/L百草枯標(biāo)準(zhǔn)液，利用本方法測(cè)其回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 百草枯核酸適配體的篩選

由于本研究組前期利用19個(gè)堿基的引物與文庫(kù)雜交[8]，導(dǎo)致靶標(biāo)洗脫的親和序列不多，所以本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[26]的思路設(shè)計(jì)了12個(gè)堿基的引物P3。百草枯核酸適配體的篩選具體流程如圖1A所示，首先將ssDNA隨機(jī)文庫(kù)與生物素修飾的P3序列通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，按摩爾比1∶2混勻，經(jīng)退火處理后與鏈霉素親和素修飾的納米磁珠結(jié)合，再加入百草枯靶標(biāo)洗脫具有親和力的ssDNA序列。根據(jù)洗滌下來(lái)的ssDNA量/固定在磁珠上的ssDNA量，計(jì)算每輪篩選的洗脫率。由于百草枯的吸收峰與核酸分子在260 nm處的吸收峰較接近，所以在計(jì)算洗脫率時(shí)排除百草枯自身的干擾。如圖1B所示，在相同百草枯濃度下，隨篩選輪數(shù)的增加，洗脫率越來(lái)越大; 逐漸減小靶標(biāo)濃度，百草枯洗脫下來(lái)的序列親和性越來(lái)越強(qiáng)。經(jīng)過(guò)前9輪篩選，發(fā)現(xiàn)50 μmol/L百草枯對(duì)固定親核性序列的洗脫率達(dá)到22.3%。對(duì)9輪篩選得到的非對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增液進(jìn)行電泳與凝膠染色處理，其結(jié)果如圖1C所示。前兩輪電泳由于引物二聚體、非特異性擴(kuò)增等因素導(dǎo)致產(chǎn)物不純，條帶出現(xiàn)混雜現(xiàn)象。其后擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸形成單一條帶，表明ssDNA序列純度逐漸提高，親和力越來(lái)越強(qiáng)，且每輪條帶均在50～100 bp之間，完全符合文庫(kù)設(shè)計(jì)范圍。

3.2 百草枯核酸適配體序列分析

根據(jù)本研究組前期研究結(jié)果 [8]和文獻(xiàn)報(bào)道，通常固定文庫(kù)法篩選適配體時(shí)， 靶標(biāo)對(duì)固定序列的洗脫率在20%～30%。本實(shí)驗(yàn)考慮篩選效率以及其它不確定性等因素，最終對(duì)第9輪篩選后的百草枯親和序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并委托上海生工生物有限公司進(jìn)行克隆，然后挑選克隆子進(jìn)行測(cè)序，最終獲得15條與文庫(kù)堿基數(shù)一致的親和序列，并分析了它們隨機(jī)區(qū)域的堿基組成與分布，所有結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)MEGA軟件進(jìn)行發(fā)育樹(shù)分析（圖1D），進(jìn)一步分析隨機(jī)序列組成與百草枯結(jié)合的關(guān)系。對(duì)15條親和序列的隨機(jī)區(qū)域進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，PQ-1和PQ-3序列隨機(jī)區(qū)都出現(xiàn)了保守序列“CGGGTGG”，PQ-4和PQ-7隨機(jī)區(qū)都出現(xiàn)了保守序列“GAC”“CAA”序列片段，且所有序列的CG含量都比較高，因而推測(cè)百草枯分子與親和序列的結(jié)合能力，可能與百草枯分子和親和序列中的CG形成穩(wěn)定的次級(jí)鍵有關(guān)。

根據(jù)CG含量高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及自由能低等因素，挑選6條親和序列（PQ-7、PQ-8、PQ-12、PQ-13，、PQ-14和PQ-15），用Mfold軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)預(yù)測(cè)，這些序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)為主，環(huán)上均出現(xiàn)了T=G錯(cuò)配，這些莖環(huán)可能是親和序列與百草枯結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖可能起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，環(huán)則通過(guò)氫鍵、疏水作用、堿基堆積等發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化，形成高度結(jié)構(gòu)化與百草枯結(jié)合的位點(diǎn)。

3.3 核酸適配體的解離常數(shù)（Kd）測(cè)定

3.4 AuNPs聚集比色檢測(cè)百草枯原理及條件優(yōu)化

利用PQ-15序列作為百草枯的識(shí)別分子，選擇陽(yáng)離子聚合物PDDA調(diào)控的AuNPs聚集作為信號(hào)輸出，建立了基于核酸適配體的百草枯檢測(cè)方法，檢測(cè)原理如圖4A所示。PDDA水溶液具有高密度正電荷，基于靜電吸引使金納米粒子聚集，顏色由紅色變成藍(lán)色。由于適配體磷酸骨架基團(tuán)帶有負(fù)電荷，PDDA可以與PQ-15適配體通過(guò)靜電吸附形成“Duplex”結(jié)構(gòu)，此時(shí)PDDA被消耗從而不會(huì)使后續(xù)加入的AuNPs聚集，因而整個(gè)體系展現(xiàn)出紅色，并在520 nm處有最大吸收峰（圖4B）。當(dāng)體系中存在百草枯時(shí)，其先與PQ-15適配體發(fā)生親和作用形成復(fù)合物，后續(xù)再加入PDDA后會(huì)導(dǎo)致AuNPs聚集，此時(shí)整個(gè)體系展現(xiàn)出藍(lán)色，并在650 nm處有最大吸收峰，這種變化趨勢(shì)與百草枯濃度（500和1000 nmol/L）呈現(xiàn)正相關(guān)（圖4B），因此可用于百草枯的比色檢測(cè)。由于納米金的聚集程度與PQ-15適配體和PDDA的濃度相關(guān)，在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取1～20 nmol/L的PQ-15和5～25 nmol/L的PDDA進(jìn)行優(yōu)化，以A650/520表示納米金聚集程度與空白組納米金A650/520的差值△A650/520作為檢測(cè)信號(hào)。如圖4C所示，PDDA濃度為20 nmol/L達(dá)到最佳飽和狀態(tài)，少量PDDA不會(huì)使納米金完全聚集，而過(guò)多PDDA會(huì)導(dǎo)致更高的背景信號(hào)，降低傳感體系的靈敏度。在最佳PDDA濃度下， PQ-15核酸適配體濃度為5 nmol/L時(shí)，檢測(cè)信號(hào)達(dá)到最大值，適配體的使用量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響PDDA對(duì)納米金的聚集（圖4D）。

3.5 AuNPs聚集比色法檢測(cè)百草枯性能分析

采用已優(yōu)化的條件，在體系中加入50～2000 nmol/L百草枯，空白組則用雙蒸水代替，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定實(shí)驗(yàn)組與空白組A650/520的吸光差值△A650/520作為檢測(cè)信號(hào)。如圖5A所示，體系的的顏色隨百草枯濃度增加逐漸變藍(lán)，濃度增加到500 nmol/L時(shí)，顏色基本達(dá)到飽和?！鰽650/520與百草枯濃度在50～500 nmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為△A650/520=0.843×104x+0.108 （R2=0.994）。根據(jù)本研究組前期報(bào)道[25]，通過(guò)3σ/slope計(jì)算得到檢出限為25.2 nmol/L（≈6.48 μg/L），低于中國(guó)農(nóng)業(yè)部制定的果蔬產(chǎn)品中百草枯最大殘留量標(biāo)準(zhǔn)（50 μg/L）。分別選取甲拌磷、啶蟲(chóng)脒、敵敵畏、辛硫磷、丙溴磷、甲基對(duì)硫磷作為競(jìng)爭(zhēng)性農(nóng)藥，采用本方法測(cè)定，結(jié)果表明，檢測(cè)體系中存在百草枯時(shí)，納米金發(fā)生聚集變藍(lán)，而加入其它農(nóng)藥的樣品組中納米金均保持紅色，PQ-15適配體對(duì)百草枯的檢測(cè)信號(hào)明顯高于其它競(jìng)爭(zhēng)性農(nóng)藥。當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性靶標(biāo)中加入同等濃度的百草枯后，檢測(cè)信號(hào)又恢復(fù)（圖5B），說(shuō)明PQ-15適配體能特異識(shí)別百草枯農(nóng)藥，且其它農(nóng)藥對(duì)百草枯的檢測(cè)不產(chǎn)生干擾。

4 結(jié) 論

通過(guò)磁分離，經(jīng)過(guò)9輪篩選獲得百草枯的高親和性寡聚核苷酸。將所得到的親和序列進(jìn)行克隆測(cè)序，得到15條完整序列。用MEGA和Mfold 軟件分析發(fā)育樹(shù)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)所得序列大多為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對(duì)親和序列進(jìn)行親和力表征，百草枯核酸適配體PQ-15具有很強(qiáng)的親和性（Kd=（54±4） nmol/L），但百草枯與其適配體的結(jié)合機(jī)理還有待進(jìn)一步探索。以親和序列作為百草枯的識(shí)別分子，以陽(yáng)離子化合物聚集的納米金為傳感信號(hào)，建立了基于核酸適配體識(shí)別的百草枯農(nóng)藥比色檢測(cè)方法，檢出限為25.2 nmol/L。本方法具有快速、靈敏、低成本且易操作的優(yōu)勢(shì)，可用于實(shí)際樣品中百草枯的檢測(cè)。

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