磁固相-內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜法快速測定人尿中的3-羥基苯并芘

劉建川 張華 黃海春 沈友起 王亞男 張小平

摘 要 將磁固相萃?。∕SPE）和內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜（iEESI-MS）技術(shù)相結(jié)合， 建立了直接快速檢測人尿液中痕量PAHs代謝物3-羥基苯并芘（3-OHBaP）的方法， 并將此方法應(yīng)用于吸煙人群與不吸煙人群尿樣中3-OHBaP的檢測。本研究以聚吡咯包覆的Fe3O4磁性納米顆粒材料作為MSPE的介質(zhì)， 通過優(yōu)化各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)（如固液比、毛細(xì)管電壓、洗脫液組成、洗脫體積等）， 將吸附了尿液中3-OHBaP的納米材料作為整體樣品直接進(jìn)行iEESI-MS分析， 以m/z 239的信號(hào)強(qiáng)度為定量指標(biāo)， 獲得最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果表明， 尿樣基質(zhì)中3-OHBaP在0.0005～2.500 μg/L濃度范圍內(nèi)與m/z 239的信號(hào)強(qiáng)度的線性關(guān)系良好， 檢出限低至0.1 ng/L， 精密度（RSDs）小于8%， 整個(gè)樣品分析過程不超過4 min， 且吸煙志愿者尿液中3-OHBaP濃度明顯高于不吸煙志愿者。本方法操作簡單、快速、環(huán)境友好， 可為人群健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 磁固相萃取; 內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜; 多環(huán)芳烴; 3-羥基苯并芘; 健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

1 引 言

苯并芘即苯并[α]芘（BaP）， 由5個(gè)苯環(huán)組成， 其分布廣泛， 且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定難以降解， 是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境化學(xué)致癌物[1]， 其致癌性最強(qiáng)， 分布最廣， 在食品、大氣、水體、土壤等中廣泛存在[2]。BaP可通過食物鏈的方式向人體轉(zhuǎn)移， 最終在人體內(nèi)蓄積。有研究表明， BaP在體內(nèi)經(jīng)功能氧化酶（如CYP1A1）代謝活化后， 形成二氫二醇環(huán)氧化物、反式二羥環(huán)氧苯并芘等， 這些代謝物很容易與DNA結(jié)合形成加合物， 導(dǎo)致基因的突變和非正常表達(dá)[3]。該DNA加合產(chǎn)物已在吸煙者的肺中被發(fā)現(xiàn)， 可直接導(dǎo)誘導(dǎo)腫瘤的形成， 在肺癌患者中表現(xiàn)尤為明顯[4]。人通過空氣、水、食物等不同程度的暴露接觸BaP， 還容易誘發(fā)肺癌、皮膚癌、胃癌等多種疾病[5， 6]。此外， BaP的毒性具有長期和隱匿的特點(diǎn)， 在表現(xiàn)出癥狀前潛伏期可達(dá)25年左右[5]。因此， 建立快速、準(zhǔn)確、高效地監(jiān)測人體暴露BaP水平的檢測方法， 對保障人類健康以及環(huán)境治理等具有重要意義。

3-羥基苯并[a]芘（3-OHBaP）是BaP的代謝標(biāo)志物[7]。 因此，可通過檢測人尿中BaP的代謝物（3-OHBaP）含量， 監(jiān)測人體內(nèi)BaP的暴露水平[7～10]。 目前， BaP代謝物檢測方法主要包括高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[9， 10]等。其中， HPLC-FLD方法操作繁瑣， 耗時(shí)費(fèi)力， 且靈敏度較低。GC-MS和HPLC-MS/MS方法具有靈敏度高和準(zhǔn)確等特點(diǎn)， 然而， 這些方法通常需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程， 限制了對BaP的高通量分析， 不能滿足對人體BaP暴露量快速評(píng)價(jià)的需要。因此， 開發(fā)簡單、高選擇性、高通量的方法分析人尿中痕量3-OHBaP顯得尤為重要。人尿基質(zhì)非常復(fù)雜， 且PAHs代謝物的含量極低。為進(jìn)一步提高PAHs代謝物檢測的靈敏度， 一些研究者利用磁性材料微孔共聚物與PAHs之間的疏水作用和π-π堆疊作用， 對復(fù)雜基體中的痕量PAHs代謝物進(jìn)行富集， 從而實(shí)現(xiàn)PAHs的高通量定性和定量分析[12～14]。本課題組前期發(fā)展了一種磁固相萃取-內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜（MSPE-iEESI-MS）的檢測方法， 首先是以聚吡咯包裹的Fe3O4作為磁固相萃取材料對尿液中的痕量1-羥基芘（1-OHP）進(jìn)行選擇特異性吸附， 再采用iEESI-MS技術(shù)進(jìn)行分析， 方法的檢出限低至0.1 ng/L[15]， 具有簡單、省時(shí)、 靈敏度高等特點(diǎn)。芘是PAHs中含量最豐富的組分之一， 因此， 在評(píng)價(jià)PAHs暴露水平時(shí)， 1-OHP（芘的主要代謝產(chǎn)物）被廣泛用作分析的目標(biāo)物。但有研究者指出， 采用尿中1-OHP進(jìn)行評(píng)價(jià)致癌PAHs的暴露程度不夠準(zhǔn)確。 首先， 芘本身是一種非致癌物; 其次， 不同地理環(huán)境中PAHs特性不同， 各成分的含量不同， 如排放源不同， 芘與BaP或其它致癌PAHs的含量比例差異很大[16， 17]。因此， 研究者們開始采用一些其它致癌物的代謝產(chǎn)物作為標(biāo)志物或同時(shí)采用多種代謝標(biāo)志物進(jìn)行評(píng)估， 如3-OHBaP、羥基菲等[18， 19]。其中， 尿液中的3-OHBaP受到特別關(guān)注， 它是致癌性BaP的主要單羥基代謝產(chǎn)物， 與1-OHP相比， 尿液中3-OHBaP更適合作為致癌性PAHs暴露的生物標(biāo)志物[18]。然而， 在體內(nèi)， BaP可被代謝轉(zhuǎn)化為酚類、二醇類、酮類或環(huán)氧類， 而這些代謝物主要隨糞便排出， 尿液中3-OHBaP的含量極低（pg/mL級(jí)別）， 比尿液中1-OHP的含量要低幾個(gè)數(shù)量級(jí)[16]。因此， 準(zhǔn)確測定復(fù)雜尿液基質(zhì)中低濃度的3-OHBaP難度較大。在前期研究基礎(chǔ)上， 本研究采用MSPE-iEESI-MS技術(shù)對人尿液樣品中的痕量3-OHBaP進(jìn)行高效、高選擇性、高通量定量分析， 并將此方法應(yīng)用于吸煙人群和不吸煙人群志愿者尿樣中3-OHBaP的快速檢測。通過對比分析不同人群尿樣中3-OHBaP的含量， 可監(jiān)測人體內(nèi)BaP暴露水平， 為人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

MSPE裝置和iEESI離子源均由本實(shí)驗(yàn)室研制[15]; LTQ-XL線性離子阱質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）， 采用Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。3-OHBaP（GR級(jí)， 美國AuccStandard Inc公司）; 甲醇和乙酸（HLPC級(jí)， 美國ROE Scientfic公司）; 丙酮和苯（AR級(jí)， 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2.2 磁固相萃取材料（Fe3O4@Ppy）的制備

聚吡咯涂覆的Fe3O4磁鐵礦納米復(fù)合材料合成方法參照文獻(xiàn)[13， 20， 21]。首先采用溶劑熱法制得磁性Fe3O4納米球顆粒：稱取5.0 g FeCl3·6H2O， 溶于100 mL乙二醇中， 加入15.0 g醋酸鈉固體和50 mL乙二胺， 攪拌0.5 h， 將溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中， 于200℃條件反應(yīng)8 h， 再用乙醇/水清洗數(shù)次， 得到磁性顆粒， 于60℃真空烘干， 備用。

稱取磁性Fe3O4納米球顆粒1.0 g、 FeCl3·6H2O 9.1 g， 加入100 mL去離子水， 室溫下?lián)u振3 h， 使Fe3+聚集在納米球表面， 加入20 mL十二烷基磺酸鈉和0.5 mL吡咯單體， 繼續(xù)搖振反應(yīng)12 h， 再用乙醇/水清洗數(shù)次， 至上清液澄清， 于60℃真空烘干， 即得到聚吡咯包裹磁性Fe3O4復(fù)合材料。

2.3 尿液樣本的采集

尿液樣本由12名健康志愿者（7名不吸煙者和5名吸煙者）提供。收集每位志愿者晨尿于100 mL棕色玻璃瓶中， 在80℃保存， 實(shí)驗(yàn)前將尿液室溫解凍。利用Fe3O4@Ppy材料對3-OHBaP的特異性吸附作用， 在尿液樣品中加入過量的Fe3O4@Ppy材料， 吸附去除可能存在的3-OHBaP， 再采用磁鐵將Fe3O4@Ppy材料吸附分離， 剩余的尿液樣本作為空白。取適量3-OHBaP標(biāo)準(zhǔn)品， 用甲醇配制成100 μg/mL的儲(chǔ)備液， 于4℃保存， 實(shí)驗(yàn)時(shí)配制一系列濃度（0.0005～2.500 μg/L）的加標(biāo)尿液樣本， 用于MSPE-iEESI-MS分析。

2.4 MSPE-iEESI-MS方法的建立

MSPE-iEESI-MS的工作流程參見本課題組前期工作[15]。原理為：依據(jù)Fe3O4@Ppy對3-OHBaP的特異性吸附作用， 將磁固相萃取介質(zhì)Fe3O4@Ppy與iEESI-MS技術(shù)結(jié)合， 對人尿中痕量3-OHBaP進(jìn)行吸附， 再將吸附了3-OHBaP的Fe3O4@Ppy作為整體樣品， 選取合適的萃取劑進(jìn)行洗脫， 最后進(jìn)入質(zhì)譜分析。具體步驟如下：稱取0.1 mg Fe3O4@Ppy于15 mL玻璃瓶中， 依次分別加入2 mL甲醇和2 mL去離子水進(jìn)行超聲活化30 s， 磁分離; 移取10 mL尿液樣品于上述玻璃瓶中， 渦旋1 min， 使Fe3O4@Ppy充分吸附尿樣中的痕量3-OHBaP， 再將混合物裝入2.5 mL進(jìn)樣針中， 用磁鐵將材料吸附在注射器的內(nèi)壁上， 將尿液排出。為了避免尿基質(zhì)對3-OHBaP電噴霧溶液造成干擾， 用1 mL去離子水洗滌進(jìn)樣針中的Fe3O4@Ppy兩次， 再加入萃取劑將Fe3O4@Ppy上的3-OHBaP進(jìn)行洗脫， 輕輕搖晃使萃取劑與Fe3O4@Ppy充分混合， 使洗脫效果達(dá)到最佳。

3 結(jié)果與討論

3.1 人尿中3-OHBaP的MSPE-iEESI-MS快速定性分析

3.2 人尿中3-OHBaP的MSPE-iEESI-MS快速定量分析

向10 mL空白尿樣中加入一系列（0.0005～2.500 μg/L）的3-OHBaP標(biāo)準(zhǔn)溶液， 在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下， 采用MSPE-iEESI-MS進(jìn)行快速檢測分析， 每個(gè)濃度樣品重復(fù)測定6次， 繪制特征離子m/z 239信號(hào)強(qiáng)度的平均值與3-OHBaP對應(yīng)濃度的關(guān)系曲線。 結(jié)果表明， 采用MSPE-iEESI-MS方法可以快速定量檢測人尿中痕量3-OHBaP， 在0.0005～2.50 μg/L濃度范圍內(nèi)， 3-OHBaP的二級(jí)離子信號(hào)強(qiáng)度與其濃度具有良好的線性關(guān)系， 線性回歸方程為y = 5.063x + 1.555（R2 = 0.9989）（圖3）， 對3-OHBaP的檢出限為0.1 ng/L[23]， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于8%。單個(gè)樣品分析時(shí)間小于4 min。上述結(jié)果表明， 對于含有ng/L級(jí)的3-OHBaP未稀釋的尿樣本， 可不經(jīng)過復(fù)雜預(yù)處理， 直接采用MSPE-iEESI-MS進(jìn)行檢測。這是因?yàn)榇判圆牧螰e3O4@Ppy對尿液中3-OHBaP的高效選擇性與特異性吸附， 以及MSPE-iEESI-MS特有的樣品加載過程， 有效避免了目標(biāo)物的損失。采用MSPE技術(shù)可對大批量的尿液樣本進(jìn)行快速處理， 進(jìn)一步提高分析通量。

3.3 尿樣中3-OHBaP的快速測定

采用本方法對12名健康志愿者（其中5名吸煙者和7名不吸煙者）實(shí)際尿液樣本中的痕量3-OHBaP進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1， 在非吸煙者尿液中檢測到的3-OHBaP濃度為0.23～0.76 μg/L， 而經(jīng)常吸煙者尿液中的3-OHBaP含量均大于1.48 μg/L。

4 結(jié) 論

采用MSPE-iEESI-MS技術(shù)， 對人尿樣中3-OHBaP進(jìn)行了定性和定量分析。此方法操作簡單、省時(shí)、環(huán)境友好， 能夠區(qū)分吸煙者與不吸煙者人體內(nèi)痕量3-OHBaP內(nèi)部劑量的差異性， 可為人體內(nèi)PAHs暴露的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考依據(jù)。本研究結(jié)果表明， 將常壓質(zhì)譜技術(shù)與MSPE結(jié)合， 可為復(fù)雜基體生物和環(huán)境樣品中痕量待測物的高通量分析提供有效的策略。

References

1 Juhasz A L， Naidu R. Int. Biodeterior. Biodegrad.， 2000， 45（1）： 57-88

2 Vasiluk L， Pinto L J， Tsang W S， Gobas F A P C， Eickhoff C， Moore M M. Food Chem. Toxicol.， 2008， 46（2）： 610-618

3 Nebert D W， Dalton T P， Okey A B， Gonzalez F J. J. Biol. Chem.， 2004， 279（23）： 23847-23850

4 Marie-Desvergne C， Matre A， Bouchard M， Ravanat J L， Viau C. Chem. Res. Toxicol.， 2010， 23（7）： 1207-1214

5 SHI Qiao-Qiao， XI Jun， LU Qi-Yu. Science and Technology of Food Industry， 2014， 35（5）： 379-381史巧巧， 席 俊， 陸啟玉. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（5）： 379-381

6 Qiu C， Peng B， Cheng S， Xia Y， Tu B. Am. J. Ind. Med.， 2013， 56（3）： 347-355

7 Barbeau D， Matre A， Marques M. Analyst， 2011， 136（6）： 1183-1191

8 Yao L， Yang J， Liu B， Zheng S， Wang W， Zhu X， Qian X. Anal. Methods， 2014， 6（16）： 6488-6493

9 Zhang X， Hou H， Xiong W， Hu Q. J. Anal. Methods Chem.， 2015： Article ID 514320

10 Luo K， Gao Q， Hu J. J. Chromatogr. A， 2015， 1379： 51-55

11 Romanoff L C， Li Z， Young K J， Blakely N C， Patterson D G， Sandau C D. J. Chromatogr. B， 2006， 835（1）： 47-54

12 Zhou L， Hu Y， Li G. Anal. Chem.， 2016， 88（13）： 6930-6938

13 Xu S N， Zhao Q， He H B， Yuan B F， Feng Y Q， Yu Q W. Anal. Methods， 2014， 6（17）： 7046-7053

14 WEN Hai-Bin， HU Yu-Ling， LI Gong-Ke. Journal of Instrumental Analysis， 2017， 36（10）： 1214-1218溫海濱， 胡玉玲， 李攻科. 分析測試學(xué)報(bào)， 2017， 36（10）： 1214-1218

15 Zhang H， Lu H， Huang H， Liu J， Fang X， Yuan B F， Feng Y Q， Chen H. Anal. Chim. Acta， 2016， 926： 72-78

16 Barbeau D， Persoons R， Marques M， Hervé C， Laffitte-Rigaud G， Maitre A. Ann. Occup. Hyg.， 2014， 58（5）： 579-590

17 Gendre C， Lafontaine M， Morele Y， Payan J P. Polycyclic Aromat. Compd.， 2002， 22（3）： 761-769

18 Hu H， Liu B， Yang J， Lin Z， Gan W. J. Chromatogr. B， 2016， 1027： 200-206

19 Rossbach B， Preuss R， Letzel S， Drexler H， Angerer J. Int. Arch. Occ. Env. Hea.， 2007， 81（2）： 221-229

20 Gao Q， Luo D， Bai M， Chen Z W， Feng Y Q. J. Agric. Food Chem.， 2011， 59（16）： 8543-8549

21 Chen D， Zheng H-B， Huang Y Q， Hu Y N， Yu Q W， Yuan B F， Feng Y Q. Analyst， 2015， 140（16）： 5662-5670

22 Bataineh M， Lübcke-von Varel U， Hayen H， Brack W. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2010， 21（6）： 1016-1027

23 Yang S， Ding J， Zheng J， Hu B， Li J， Chen H， Zhou Z， Qiao X. Anal. Chem.， 2009， 81（7）： 2426-2436