基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的酪氨酸酶可拋式傳感器研究

甘振飛 汪璐 郭丹 李大偉

摘 要 研制了一種可拋式表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）傳感器用于檢測(cè)血清中酪氨酸酶（TYR）活性。首先制備了功能化銀納米顆粒漿料，采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備SERS傳感器。修飾在傳感器上的4-巰基鄰苯二酚可被酪氨酸酶催化氧化為4-巰基鄰苯二醌，引起傳感器SERS光譜的顯著變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)酪氨酸酶的檢測(cè)。此傳感器對(duì)酪氨酸酶響應(yīng)快速，在優(yōu)化條件下5 min內(nèi)即可完成檢測(cè); 特征SERS信號(hào)強(qiáng)度與酪氨酸酶濃度在1～100 U/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.28 U/mL（3σ）。由于檢測(cè)反應(yīng)的特異性和SERS技術(shù)可提供指紋信息的綜合優(yōu)勢(shì)，此傳感器有較好的抗干擾性能。血清樣品中的加標(biāo)回收率為88.1%～104.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于4%，可準(zhǔn)確反映苯甲酸的含量及其對(duì)酪氨酸酶的抑制能力。結(jié)果表明，所研制的可拋式SERS傳感器可一次性使用，適合生物樣品中酪氨酸酶的快速分析，以及酪氨酸酶抑制劑的快速篩選和檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 表面增強(qiáng)拉曼光譜; 酪氨酸酶; 傳感器; 可拋式

1 引 言

酪氨酸酶（TYR）作為一種重要的氧化還原酶，可將鄰苯二酚類物質(zhì)催化氧化為鄰苯二醌類化合物，參與人體內(nèi)黑色素的合成[1]。研究表明，人體血清中酪氨酸酶活性正常水平約為6.5～9.5 U/mL[2]， 酪氨酸酶不足會(huì)導(dǎo)致白癜風(fēng)[3]; 過表達(dá)時(shí)，則可引起雀斑[4]和帕金森氏綜合征[5]，是黑色素瘤的標(biāo)志物之一[6]。因此檢測(cè)生物樣本中的酪氨酸酶具有重要的臨床意義[7]。目前，用于檢測(cè)酪氨酸酶的方法主要有比色法[8]、電化學(xué)法[9]和熒光法[10～13]等，這些方法或操作簡便、或靈敏度較高，但在酪氨酸酶活性實(shí)際檢測(cè)中也面臨著一些挑戰(zhàn)，如特異性不強(qiáng)、受光漂白或光毒性影響等[14～17]。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）能提供分子指紋信息，具有靈敏度高、檢測(cè)快速等優(yōu)勢(shì)[18～20]。SERS技術(shù)已被用于蛋白等生物分子的檢測(cè)分析，但由于蛋白分子較為復(fù)雜，SERS譜圖的解析較為困難，使其直接檢測(cè)受到限制[21]。而基于化學(xué)反應(yīng)的SERS傳感策略則有望克服此類問題，該策略將具有SERS活性和與待測(cè)物反應(yīng)的性能集于傳感器或探針，可產(chǎn)生靈敏清晰的SERS信號(hào)，只需要觀察傳感器或探針與目標(biāo)檢測(cè)物反應(yīng)前后產(chǎn)生的光譜變化即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[22]。Li等[23]基于疊氮化合物與硫化氫的特異性反應(yīng)，研制了新型高靈敏特異性SERS納米傳感器，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞中硫化氫氣體信號(hào)分子的原位監(jiān)測(cè)。

絲網(wǎng)印刷技術(shù)具有印制過程均勻可控，以及網(wǎng)印產(chǎn)品重現(xiàn)性好、小巧便攜、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)[24]。Qu等[25]利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)批量制備出穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高，且易于保存攜帶的可拋式SERS傳感器，對(duì)羅丹明6G的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1013 mol/L，并且方便大批量樣品檢測(cè)中一次性使用，避免交叉污染。但血清中酪氨酸酶的絲網(wǎng)印刷SERS傳感器研究尚未見報(bào)道。

本研究結(jié)合SERS和絲網(wǎng)印刷傳感器的優(yōu)勢(shì)，制備了一種用于檢測(cè)酪氨酸酶的可拋式SERS傳感器，優(yōu)化了檢測(cè)條件，為血清中酪氨酸酶檢測(cè)和酪氨酸酶抑制劑篩選提供了靈敏快捷的分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

USB2000紫外-可見光譜儀（美國Ocean Optics 公司）; Ultra 55掃描電子顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）; JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）; BWS415便攜式激光拉曼光譜儀（美國B&W Tek公司）; AT-259A絲網(wǎng)印刷機(jī)（東遠(yuǎn)精技工業(yè)有限公司）。

AgNO3（99%）、檸檬酸三鈉（≥99%）、KCl（≥99%）、羧甲基纖維素鈉（CMC，Mw=70000，粘度≥1200 mPas）和酪氨酸酶（≥1，000 U/mg）購于Sigma-Aldrich公司; 谷胱甘肽（GSH， 95%）、尿素（99%）和NaCl（≥99.5%）購于阿拉丁試劑有限公司。Gibco 胎牛血清購于Thermo Fisher 公司。NaClO（99.7%）和H2O2（30 %）購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水（18 MΩ cm）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 4-巰基鄰苯二酚的合成 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將0.85 g 3，4-二甲氧基苯基甲硫醇冰浴冷卻至

10℃; 加入2.50 g BBr3，反應(yīng)12 h; 然后分離有機(jī)相，干燥，提純得到4-巰基鄰苯二酚[26]。質(zhì)譜表征顯示， 合成物在m/z 142.0090處有一個(gè)強(qiáng)峰，與4-巰基鄰苯二酚相吻合。

2.2.2 絲網(wǎng)印刷漿料的制備

按照文獻(xiàn)[27]方法制備銀納米顆粒，制備好的銀膠于4℃保存。制備絲網(wǎng)印刷銀漿時(shí)，在銀納米顆粒上修飾4-巰基鄰苯二酚， 6500 r/min離心5 min，移除99%上層清液，與4.0%羧甲基纖維素鈉（CMC）按照3∶1（V/V）混合，制得絲網(wǎng)印刷漿料。

2.2.3 酪氨酸酶?jìng)鞲衅鞯闹苽?依據(jù)設(shè)計(jì)的陣列網(wǎng)板，參考文獻(xiàn)[25]中的方法，在紙質(zhì)基體上利用絲網(wǎng)印刷機(jī)分層印刷碳漿和4-巰基鄰苯二酚功能化的銀納米顆粒漿料，印制SERS傳感器陣列。主要印制過程為：將紙質(zhì)基體與陣列網(wǎng)板分別固定于絲網(wǎng)印刷機(jī)的相應(yīng)位置并將印刷漿料放置于網(wǎng)板一端，利用刮刀擠壓漿料透過陣列圖形區(qū)域，然后將印制好的傳感器陣列從絲網(wǎng)印刷機(jī)中取出烘干，保存。

2.2.4 酪氨酸酶的檢測(cè) 酪氨酸酶用K2HPO4-KH2PO4緩沖液（50 mmol/L， pH=5.6）溶解，分裝后，于

20℃避光儲(chǔ)存，使用時(shí)取出，在37℃融解。將酪氨酸酶溶液（25 kU/mL）梯度稀釋，加入到1 mL K2HPO4-KH2PO4緩沖液（10 mmol/L， pH=7.4）中，獲得不同濃度的酪氨酸酶溶液。將SERS傳感器插入溶液，于37℃孵育5 min，取出傳感器，采集拉曼光譜。血清加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)采用相似步驟完成檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測(cè)原理

通過在銀納米顆粒上修飾新合成的4-巰基鄰苯二酚，并將其印刷到已印有碳層的紙質(zhì)基體上，制備可拋型酪氨酸酶SERS傳感器。如圖1所示，在氧氣存在下，酪氨酸酶可將傳感器上的4-巰基鄰苯二酚的羥基催化氧化為羰基，導(dǎo)致傳感器的SERS光譜發(fā)生變化，并產(chǎn)生新的SERS譜峰?；谶@一特征性SERS光譜信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中酪氨酸酶的檢測(cè)分析。

3.2 傳感器表征

所制備的SERS傳感器陣列有10×4個(gè)傳感點(diǎn)位，每個(gè)傳感點(diǎn)位約為28 mm2，可裁剪為單個(gè)可拋式傳感器，獨(dú)立完成便攜檢測(cè)（圖2A）。掃描電鏡表征顯示（圖2B），傳感器上的銀納米顆粒為球形，直徑約50 nm，且粒徑分布均勻，具有較好的SERS增強(qiáng)活性[28]。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，傳感器與酪氨酸酶孵育后，SERS光譜發(fā)生明顯變化，在484 cm1處出現(xiàn)新的信號(hào)峰（圖2C）。通過密度泛函理論計(jì)算可知，484 cm1處譜峰主要來自于CO振動(dòng)，而784、898和1071cm1處譜峰歸因于COH與CCC的振動(dòng)疊加。如前所述，這是由于酪氨酸酶催化氧化作用所致，表明傳感器對(duì)酪氨酸酶有優(yōu)良的SERS響應(yīng)能力。此外，傳感器制備的重現(xiàn)性考察實(shí)驗(yàn)表明，隨機(jī)選取10個(gè)傳感點(diǎn)位的SERS譜圖基本一致（圖3A），并且在1071 cm1處代表性譜峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)（圖3B），重現(xiàn)性良好。

3.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

優(yōu)化了孵育pH值、溫度和時(shí)間等酪氨酸酶的檢測(cè)條件。由圖4A和圖4B可知，pH值從5.0增長到7.4時(shí)，表面增強(qiáng)拉曼光譜中拉曼位移484 cm

1處的峰強(qiáng)度（I484）隨之增強(qiáng)，pH值>7.4時(shí)，I484減弱; 檢測(cè)溫度在37℃、pH=7.4時(shí)，I484最強(qiáng); 這可能是由于此時(shí)酪氨酸酶活性最大[29]，因此更適合傳感器檢測(cè)。由圖4C可見，I484隨孵育時(shí)間延長而增強(qiáng)，時(shí)間超過5 min后，I484基本保持不變，表明酪氨酸酶催化反應(yīng)達(dá)到平衡，所以選擇酪氨酸酶的檢測(cè)時(shí)間為5 min。即本傳感器可以在5 min內(nèi)完成檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)酪氨酸的快速分析[30～32]。

3.4 抗干擾性

3.5 傳感器分析性能

3.6 血清樣品分析

為評(píng)估所研制的傳感器分析生物樣品中酪氨酸酶的可行性，對(duì)胎牛血清（FBS）中TYR進(jìn)行了檢測(cè)。如表2所示，4個(gè)加標(biāo)水平下，酪氨酸酶的回收率在88.1%～104.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.5%～3.4%之間，良好的檢測(cè)性能可能是由于酶催化反應(yīng)的專一性和SERS傳感器的高重現(xiàn)性和選擇性，表明所研制傳感器可用于血清樣品中酪氨酸酶的檢測(cè)。

3.7 TYR抑制劑的篩選和評(píng)估

4 結(jié) 論

合成了4-巰基鄰苯二酚功能化銀納米顆粒漿料，采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備了可拋式SERS傳感器，用于檢測(cè)TYR。此傳感器重現(xiàn)性高，SERS信號(hào)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%; 在優(yōu)化條件下，5 min內(nèi)即可完成TYR的快速檢測(cè); 傳感器制備和檢測(cè)方法簡單，抗干擾能力強(qiáng)，對(duì)TYR的檢出限低于0.3 U/mL，血清樣品中加標(biāo)回收率為88.1%～104.6%。此傳感器在酪氨酸酶活性分析及其抑制劑篩選檢測(cè)相關(guān)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用潛力。

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