腎盂尿液熒光原位雜交檢測(cè)在腎盂上皮細(xì)胞癌診斷中的價(jià)值

陸勇，何雪峰，平季根

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006)

腎盂惡性腫瘤占全部腎臟惡性腫瘤約7%～8%，其中90%為泌尿系統(tǒng)上皮來(lái)源。臨床上，腎盂腫瘤的診斷主要依靠尿脫落細(xì)胞學(xué)和影像學(xué)檢查，但是這些檢查方法往往會(huì)延誤腎盂腫瘤的早期診斷[1,2]。研究證實(shí)，對(duì)尿液進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)診斷膀胱上皮細(xì)胞癌的敏感性明顯優(yōu)于脫落細(xì)胞學(xué)，特異性與脫落細(xì)胞學(xué)檢查相當(dāng)[3～5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)尿液進(jìn)行FISH檢測(cè)診斷上尿路上皮細(xì)胞癌同樣具有較高的敏感性和特異性；但是，由于尿液取材通常為晨尿，常存在尿液標(biāo)本中細(xì)胞收集數(shù)量不足等因素，使FISH檢測(cè)對(duì)于早期上尿路上皮腫瘤的診斷率仍不是十分理想[6～8]。因此，本研究采用經(jīng)膀胱鏡下輸尿管置管后收集腎盂尿液進(jìn)行FISH檢測(cè)，并與常規(guī)收集晨尿標(biāo)本檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)估經(jīng)膀胱鏡下輸尿管置管后收集腎盂尿液行FISH檢測(cè)對(duì)腎盂上皮細(xì)胞癌的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年10月～2016年12月在我院疑診為腎盂占位的患者44例，男30例、女14例，年齡(67.0±1.2)歲。均行泌尿系統(tǒng)CT、逆行上尿路造影以及膀胱鏡檢查，排除膀胱腫瘤和輸尿管腫瘤可能。排除腎功能不全以及泌尿系統(tǒng)感染的患者?；颊呔谢铙w組織病理快速檢查，以組織病理學(xué)診斷作為確診腎盂上皮細(xì)胞癌的金標(biāo)準(zhǔn)。同期，收集20名健康志愿者的晨尿行FISH檢測(cè)，以建立正常人群的閾值。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并告知患者及志愿者，簽署知情同意書(shū)。

1.2 尿液取材方法 所有患者在行膀胱鏡檢查前、健康志愿者在清晨，留取晨尿100 mL。然后對(duì)疑診腎盂占位患者局麻，膀胱鏡下從患側(cè)輸尿管開(kāi)口插入F5輸尿管導(dǎo)管至腎盂，留置F5輸尿管導(dǎo)管，收集腎盂尿液共100 mL。所有尿液樣本均在2 h內(nèi)送檢行FISH檢測(cè)。

1.3 FISH檢測(cè)方法 收集尿液中的細(xì)胞進(jìn)行樣本玻片制備及預(yù)處理，尿液標(biāo)本置于兩個(gè)50 mL離心管中經(jīng)5次離心，去上清。離心過(guò)程中，依次加入膠原酶B(0.005 g/5 mL Hank′s BSS)，KCL低滲溶液，固定液(甲醇∶冰醋酸3∶1)，吹打懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞滴于玻片上，56 ℃環(huán)境中老化玻片。RNaseA溶液處理完畢后，立即將玻片置于37 ℃胃蛋白酶溶液中，室溫下于2×SSC(pH 7.0)溶液中漂洗玻片2次。將玻片依次置于-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脫水，自然干燥玻片。將標(biāo)本、探針混合物置于(73±1)℃水浴箱中變性。玻片經(jīng)梯度脫水，自然干燥后，與探針雜交。將10 μL變性后的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域，置于預(yù)熱的濕盒中，42 ℃保溫箱中過(guò)夜雜交。玻片經(jīng)洗滌后，置暗處自然干燥。將15 μL DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域位置，在熒光顯微鏡下選用合適的濾波片組觀察玻片。

1.4 FISH結(jié)果分析與判定 所用的FISH探針包括兩種組合，CSP3/CSP7和GLP P16/CSP17探針，探針位點(diǎn)分別為3p11.1-q11.1/7p11.1-q11.1和9p21/17p11.1-q11.1，正常情況熒光顯微鏡下均可見(jiàn)2紅與2綠兩種顏色信號(hào)。異常信號(hào)主要表現(xiàn)為：3、7、17號(hào)染色體主要表現(xiàn)為非整倍體擴(kuò)增，即細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)多于2個(gè)信號(hào)的表現(xiàn)；p16位點(diǎn)表現(xiàn)為缺失，即細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)少于2個(gè)信號(hào)。觀察正常人的100個(gè)不重疊的細(xì)胞核，計(jì)數(shù)3、7、17號(hào)染色體非整倍體改變數(shù)值和p16位點(diǎn)缺失的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出異常細(xì)胞數(shù)所占百分比，根據(jù)公式[閾值=平均值(M)+3×標(biāo)準(zhǔn)差(SD)]計(jì)算出正常人的閾值。異常結(jié)果以100個(gè)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)3、7、17號(hào)染色體非整倍體改變和p16位點(diǎn)缺失的細(xì)胞百分比大于閾值為標(biāo)準(zhǔn)，且出現(xiàn)2種及以上探針信號(hào)異常時(shí)可診斷為腎盂上皮細(xì)胞癌。計(jì)數(shù)由兩名專業(yè)人員獨(dú)立完成，結(jié)果一致方可認(rèn)定，主要分析細(xì)胞核大、不典型、不規(guī)則的細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用配對(duì)資料的χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理檢查結(jié)果 經(jīng)病理檢查確診腎盂上皮細(xì)胞癌35例，均行根治性腎輸尿管全切術(shù)。術(shù)后病理結(jié)果示Tis期2例、Ta期15例、T1期13例、T2期5例；低級(jí)別尿路上皮癌26例，高級(jí)別尿路上皮癌9例；腫瘤直徑0.8～2.2(1.7±0.2)cm。術(shù)后標(biāo)本解剖發(fā)現(xiàn)，腫瘤大多體積較小，呈現(xiàn)乳頭樣或息肉樣外觀。腎臟或腎盂良性病變9例，包括腎盂炎性病變3例、腎盂血塊(血塊伴機(jī)化)1例、腎盂結(jié)石或鈣化4例、腎盂輸尿管淀粉樣變性1例。見(jiàn)圖1。

注：a為CT所見(jiàn)腎盂可疑占位(箭頭所示)，增強(qiáng)信號(hào)不明顯；b為靜脈腎盂造影，右側(cè)腎盂腎盞未見(jiàn)充盈缺損；c為術(shù)后腎盂腫瘤組織標(biāo)本，呈息肉樣外觀(箭頭所示)。

2.2 正常人尿液FISH檢測(cè)結(jié)果 20例正常人的尿液FISH檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的3、7、17號(hào)染色體非整倍體改變和p16位點(diǎn)缺失的正常閾值分別為3.9%、2.1%、2.4%和1.2%。

2.3 疑診腎盂占位患者的尿液FISH檢測(cè)結(jié)果 對(duì)患者晨尿、腎盂尿液檢測(cè)后，診斷腎盂上皮細(xì)胞癌分別為24、32例。

2.4 晨尿、腎盂尿液FISH檢測(cè)對(duì)腎盂上皮細(xì)胞癌的診斷價(jià)值比較 晨尿FISH檢測(cè)診斷腎盂上皮細(xì)胞癌的敏感性為68.6%(24/35)、特異性為77.8%(7/9)；腎盂尿液FISH檢測(cè)診斷腎盂上皮細(xì)胞癌的敏感性為91.4%(32/35)、特異性為77.8%(7/9)，經(jīng)膀胱鏡輸尿管導(dǎo)管收集腎盂尿液FISH檢測(cè)診斷腎盂上皮癌的敏感性高于晨尿(χ2=4.6，P<0.05)。

2.5 假陽(yáng)性分析 9例腎盂或腎臟良性病變患者中，出現(xiàn)FISH檢測(cè)假陽(yáng)性2例，其中1例為腎盂輸尿管淀粉樣變性、1例為泌尿系統(tǒng)炎癥，均體現(xiàn)在3、7、17號(hào)染色體的非整倍體擴(kuò)增，而未出現(xiàn)p16位點(diǎn)的缺失。9例患者經(jīng)5～36個(gè)月的嚴(yán)密隨訪，未發(fā)現(xiàn)患泌尿系上皮腫瘤的證據(jù)。

3 討論

腎盂上皮細(xì)胞癌是一種臨床上較少見(jiàn)的疾病，僅占泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤的5%[9]。目前，對(duì)于腎盂腫瘤的診斷主要依靠CT、靜脈/逆行腎盂造影、脫落細(xì)胞學(xué)和輸尿管鏡檢查。然而，對(duì)于體積較小的腎盂腫瘤，CT增強(qiáng)信號(hào)可能不明顯，腎盂造影又無(wú)充盈缺損改變，影像學(xué)資料難以明確診斷，往往延誤了疾病的治療，導(dǎo)致腎盂腫瘤預(yù)后較差[1,10]。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)上尿路腫瘤的診斷意義并不大，其檢出率只有37.5%～50.0%[11]。雖然通過(guò)輸尿管鏡檢查，可以提高上尿路腫瘤的診斷率，但輸尿管鏡是一種有創(chuàng)診斷方法，可能會(huì)造成腎盂輸尿管穿孔、出血、輸尿管撕脫等較嚴(yán)重的并發(fā)癥，并且發(fā)生在腎下盞的腫瘤，由于觀察角度受限，往往會(huì)被漏診，一些病變不明顯、無(wú)法準(zhǔn)確取到組織進(jìn)行活檢的病例也往往會(huì)被遺漏。因此，需要一種檢出率高、創(chuàng)傷性較小的方法來(lái)提高腎盂腫瘤的診斷率。

近年來(lái)，由于FISH具有較高的診斷敏感性和特異性，已被廣泛應(yīng)用于膀胱上皮細(xì)胞癌的檢測(cè)。由于膀胱和腎盂上皮屬于同一組織來(lái)源，Zhang等[12]用高通量基因芯片技術(shù)研究了腎盂和膀胱上皮腫瘤的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)這兩種腫瘤在遺傳背景上無(wú)明顯差別，僅在信號(hào)通路上存在CLCA2(1p22.3)和GABRE(Xq28)兩個(gè)基因位點(diǎn)的差異。這樣，應(yīng)用FISH檢測(cè)上尿路上皮腫瘤就有了理論基礎(chǔ)。近期，國(guó)外一些小樣本量的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)創(chuàng)性留取尿液行FISH檢查診斷上尿路上皮癌的敏感性為75%～87.5%，特異性為80%～95%[6,7]。然而，Johannes等[8]應(yīng)用FISH檢測(cè)67例上尿路腫瘤患者的尿液樣本時(shí)，發(fā)現(xiàn)FISH的診斷敏感性只有56%，認(rèn)為FISH對(duì)于上尿路腫瘤的診斷有限，原因可能是尿液中腫瘤細(xì)胞過(guò)少所致，并認(rèn)為采取有創(chuàng)方法收集尿液，有可能提高FISH診斷的敏感性。Lodde等[13]應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)上尿路上皮腫瘤時(shí)，采取輸尿管置管留取尿液的方法，診斷敏感性從75%提高到91%。Mian等[14]對(duì)尿路上皮癌研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)輸尿管置管留取尿液的方法，可以降低由于泌尿系統(tǒng)良性病變導(dǎo)致的診斷假陽(yáng)性率。我們考慮由于膀胱尿液中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量或濃度的不足，影響了FISH檢測(cè)結(jié)果，而且對(duì)懷疑腎盂上皮細(xì)胞癌的患者行膀胱鏡檢查是必須的，故采用膀胱鏡下輸尿管置管后留取腎盂尿液，行FISH檢測(cè)，可能成為腎盂上皮細(xì)胞癌診斷的一種較可靠并且創(chuàng)傷較小的方法。本研究率先在國(guó)內(nèi)采用膀胱鏡下輸尿管導(dǎo)管置入后收集腎盂尿液，應(yīng)用FISH檢測(cè)了44例疑診腎盂尿路上皮細(xì)胞癌患者的尿液樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)腎盂尿液進(jìn)行FISH檢測(cè)診斷腎盂上皮細(xì)胞癌的敏感性為91.4%，明顯高于常規(guī)晨尿檢測(cè)所得結(jié)果(68.6%)，表明通過(guò)輸尿管置管留取腎盂尿液的方法，可以提高FISH檢測(cè)腎盂上皮細(xì)胞癌的診斷敏感性。

對(duì)腎盂腫瘤的早期診斷和早期治療是提高腎盂癌預(yù)后的關(guān)鍵，因而提高早期、低級(jí)別腎盂腫瘤診斷的準(zhǔn)確性顯得十分重要。本研究中，35例腎盂上皮細(xì)胞癌有30例為非肌層浸潤(rùn)性上皮癌，26例病理為低級(jí)別，這些腎盂腫瘤患者的影像學(xué)檢查很難明確是否為腎盂尿路上皮癌，主要因?yàn)镃T檢查發(fā)現(xiàn)腎盂占位較小，病變組織增強(qiáng)信號(hào)不明顯，而且靜脈/逆行腎盂造影無(wú)明顯充盈缺損，而輸尿管留取尿液行FISH檢測(cè)則診斷出32例、敏感性為91.4%，表明采用輸尿管留取尿液行FISH檢測(cè)，對(duì)早期腎盂上皮細(xì)胞癌的診斷具有較高的敏感性。

目前，對(duì)于FISH檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的研究較少，有學(xué)者認(rèn)為，一些泌尿系統(tǒng)良性疾病包括結(jié)石、炎癥等確實(shí)存在FISH假陽(yáng)性結(jié)果，主要原因可能是有活性的淺表傘狀細(xì)胞和精囊腺細(xì)胞出現(xiàn)多倍體擴(kuò)增以及試劑廠家制定的標(biāo)準(zhǔn)閾值偏低有關(guān)，并認(rèn)為根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和患者病史綜合考慮，可以降低FISH結(jié)果的假陽(yáng)性率[15]。本研究中，F(xiàn)ISH檢測(cè)出現(xiàn)2例相同的假陽(yáng)性結(jié)果，1例為腎盂輸尿管淀粉樣變性、1例為泌尿系統(tǒng)炎癥，主要原因可能是根據(jù)正常人設(shè)定的閾值偏低所致，表明輸尿管留取尿液行FISH檢測(cè)并不能提高其檢測(cè)的特異性，通過(guò)擴(kuò)大泌尿系統(tǒng)良性疾病樣本量，重新設(shè)定閾值，有望提高FISH檢測(cè)的特異性。

綜上，應(yīng)用膀胱鏡下輸尿管置管獲取腎盂尿液的方法，能顯著提高FISH檢測(cè)腎盂上皮細(xì)胞癌的敏感性，有可能成為早期診斷腎盂上皮細(xì)胞腫瘤的一種創(chuàng)傷較小的可靠方法。