Mn2+對DNS法測定右旋糖酐發(fā)酵液中果糖含量的影響

慕 娟，問清江，孫曉宇，丁 浩

( 陜西省微生物研究所， 陜西 西安 710043)

右旋糖酐(Dextran)是一種由若干葡萄糖聚合而成的高分子聚合物，也稱葡聚糖，是一種非常重要的多糖，可用于醫(yī)藥、食品、輕工等多領(lǐng)域，例如血漿代用品，乳化劑和增稠劑，高黏度膠水，炸藥，鉆井添加劑，土壤改良劑等[1～2]。目前右旋糖酐主要是微生物發(fā)酵生產(chǎn)，腸膜狀明串珠菌(Leuconstoc mesenteriodes)以蔗糖為原料，產(chǎn)生右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase, EC2.4.5.1)，該酶以蔗糖為底物，切斷D-葡萄糖基與果糖基的糖苷鍵，形成D-葡萄糖基與酶的復(fù)合物，釋放出果糖，最后將葡糖糖基單元主要以α-1,6糖苷鍵連接形成右旋糖酐，產(chǎn)生果糖[3～6]。因此，右旋糖酐發(fā)酵液中的主要代謝產(chǎn)物有右旋糖酐、果糖和右旋糖酐蔗糖酶。在右旋糖酐發(fā)酵檢測中，由于右旋糖酐是高黏度的多糖，必須通過乙醇沉淀，烘干得出其含量，而果糖是一種還原糖，易于檢測，再者右旋糖酐蔗糖酶酶活檢測也是通過酶作用所產(chǎn)生的果糖來衡量的，因此果糖作為右旋糖酐發(fā)酵的主要檢測指標(biāo)。3,5-二硝基水楊酸(DNS)分光光度法測定還原糖，操作簡便快速、試劑消耗少、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度易達到檢測要求，因此果糖的測定采用3,5-二硝基水楊酸試劑法(DNS)[7～8]。

在研究金屬離子對右旋糖酐發(fā)酵影響中發(fā)現(xiàn)，按照常規(guī)DNS 測定還原糖法檢測，Mn2+對發(fā)酵液中的果糖和右旋糖酐兩種代謝產(chǎn)物的影響結(jié)果不同，前者隨發(fā)酵液中Mn2+濃度的增加一直增加，而后者則相反，出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。隨后在研究金屬離子對右旋糖酐蔗糖酶作用的影響時，不同Mn2+濃度的酶反應(yīng)體系作用結(jié)果檢測時，偶然發(fā)現(xiàn)，對照管的光吸收值隨Mn2+濃度的增加而增加，說明Mn2+也在檢測過程中發(fā)生反應(yīng)。本文主要通過Mn2+對右旋糖酐發(fā)酵過程中果糖和右旋糖酐蔗糖酶的檢測的影響及Mn2+和DNS的定量發(fā)應(yīng)等進行探索研究，改進DNS法測定右旋糖酐發(fā)酵液中果糖含量，為還原糖測定樣品中含有氧化還原性其他物質(zhì)時的檢測提供參考,如果檢測樣品中含有待測還原糖外的其它具有還原性的物質(zhì)時，在DNS測定還原糖時，一定要考慮其產(chǎn)生的氧化還原反應(yīng)，消除其對檢測結(jié)果的影響。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料與儀器

1.1.1 試劑與材料 果糖(D -(-)- fructose)(Sigma 公司)；3,5-二硝基水楊酸(DNS)(化學(xué)純，上?？曝S化學(xué)試劑有限公司)；苯酚(重蒸酚，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；蔗糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、氯化錳、乙酸鈉、冰醋酸、(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；白砂糖(市售一級)；菌株：Leuconstoc mesenteriodes -1226(Lm-1226)(中國藥品生物制品檢定所)。

1.1.2 儀器 722分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；SPX-150BIII生化培養(yǎng)、GH-500型隔水式培養(yǎng)箱、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱、HH-4A電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.1.3 DNS試劑 稱取10.0 g DNS于600 mL蒸餾水中，逐漸加入10.0 g氫氧化鈉，加熱(50℃水浴)攪拌至溶解，依次加入200 g酒石酸鉀鈉，2.0 g苯酚和5.0 g無水亞硫酸鈉，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1 000 mL，過濾，貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7 d后使用。

1.1.4 1 mg·mL-1果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取0.1000 g Sigma果糖(105 ℃干燥衡重)，用蒸餾水溶解并定容至100 mL。

1.1.5 1 mg·mL-1Mn2+標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取0.3076 g 分析純硫酸錳(105 ℃干燥衡重)，用蒸餾水溶解并定容至100 mL。

1.1.6培養(yǎng)基(g·L-1) 白砂糖120 g，蛋白胨 1.7 g ，磷酸氫二鈉1.4 g，pH7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 Lm-1226產(chǎn)右旋糖酐的發(fā)酵 以不同Mn2+將硫酸錳分別加入到培養(yǎng)基中，腸膜狀明串珠菌Lm-1226種子液以10%的接種量接入到培養(yǎng)基中，25 ℃，靜止培養(yǎng)28 h；取樣檢測果糖、右旋糖酐蔗糖酶，并將75%乙醇按135 mL·100 mL-1加入到發(fā)酵液中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，放置，收集沉淀，沉淀?5%乙醇洗滌3次，烘干稱重測出右旋糖酐量。

1.2.2 Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶作用的影響 右旋糖酐發(fā)酵液進行一定的稀釋，10 000 r·min-1離心15 min，收集上清液為提取液為右旋糖酐蔗糖酶酶液，在適當(dāng)稀釋的酶液中加入不同濃度的Mn2+，以蔗糖為底物，右旋糖酐蔗糖酶在Mn2+濃度不同反應(yīng)體系中作用，測定酶活力，以確定Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶作用的影響。

1.2.3 果糖、右旋糖酐蔗糖酶活力的測定

1.2.3.1 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

圖1 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用DNS法測定還原糖方法，分別量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg·mL-1)，用蒸餾水補齊1 mL，再加入2 mL DNS，沸水浴2 min，流水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm測定光吸收值，繪制果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程用于果糖和酶活測定。

1.2.3.2 果糖測定 發(fā)酵液等樣品稀釋一定倍數(shù)，取樣品1 mL加入2 mL DNS煮沸2 min顯色，然后冷水浴冷卻至室溫，定容至10 mL；蒸餾水為對照，取蒸餾水1 mL ，其余同樣品；540 nm測定吸光值，根據(jù)回歸方程得出樣品中的果糖含量果糖含量計算公式：

果糖(mg·mL-1)=[(Ae-A0) +0.1014]/1.302×Df

式中：Ae——樣品的吸光值

A0—蒸餾水空白的吸光值

Df—樣品的稀釋倍數(shù)

1.2.3.3 改進的果糖測定

發(fā)酵液等樣品稀釋一定倍數(shù)，取樣品1 mL加入2 mL DNS煮沸2 min顯色，然后冷水浴冷卻至室溫，定容至10 mL；發(fā)酵液相對應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，發(fā)酵培養(yǎng)基與相對應(yīng)的發(fā)酵液稀釋相同倍數(shù)，取樣品1 mL ，其余同樣發(fā)酵液樣品；540 nm測定吸光值，根據(jù)回歸方程得出發(fā)酵液樣品中的果糖含量。

果糖含量計算公式：

果糖(mg·mL-1)=[(Ae-A0) +0.1014]/1.302×Df

式中：Ae——樣品的吸光值

A0—培養(yǎng)基空白的吸光值

Df—樣品的稀釋倍數(shù)

1.2.3.4 右旋糖酐蔗糖酶活力測定

將酶液用pH5.4的0.2 M醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋后，取0.5 mL的酶液加入到0.5 mL10%的蔗糖溶液中，30℃準(zhǔn)確反應(yīng)1 h，加入2 mLDNS終止反應(yīng)，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對照的酶液和DNS加入順序顛倒，其余同樣品測定。以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值，樣品和空白對照的吸光值之差根據(jù)回歸方程得出反應(yīng)液中的果糖量，從而確定酶活。酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘催化蔗糖產(chǎn)生1 μmol果糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位(IU)。

酶活力計算公式：

E={[(Ae-A0) +0.1014]/1.302×Df×1 000}/(WM×t×V)

式中：E——樣品酶活力(IU·mL-1)

Ae——酶液反應(yīng)的吸光值

A0—滅活酶液空白的吸光值

Df—樣品酶液的稀釋倍數(shù)

WM——果糖分子量

t——酶反應(yīng)時間(min)

V——發(fā)應(yīng)的酶液體積(mL)

1.2.4 Mn2+與DNS試劑的作用 分別量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL Mn2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg·mL-1)，用蒸餾水補齊1 mL，再加入2 mL DNS，沸水浴2 min，流水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm測定光吸收值。

2 結(jié)果與討論

2.1 Mn2+對右旋糖酐發(fā)酵液中果糖檢測的影響

DNS法測定樣品中的還原糖一般是按照1.2.3.1和1.2.3.2的方法進行的，如此對含有不同Mn2+濃度的培養(yǎng)基經(jīng)Lm-1226培養(yǎng)發(fā)酵后的右旋糖酐發(fā)酵液進行了果糖測定，同時用乙醇沉淀法提取了發(fā)酵液中的右旋糖酐進行了定量檢測(見表1)。結(jié)果表明：果糖含量隨Mn2+濃度的增加而增加，而右旋糖酐則相反。Leuconstoc mesenteriodes -1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的機理是，蔗糖中的葡萄糖基以α-1,6糖苷鍵連接形成右旋糖酐，釋放果糖，因此二者隨Mn2+濃度變化的趨勢應(yīng)該一致，但結(jié)果出現(xiàn)異常，需要進一步研究。

2.2 Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶活力檢測的影響

右旋糖酐蔗糖酶在不同Mn2+濃度的發(fā)應(yīng)體系中作用結(jié)果見表2，在1.25～7.5 mmol·L Mn2+濃度范圍內(nèi)，右旋糖酐蔗糖酶作用開始隨著Mn2+濃度的增加而增強，5.0 mmol·L-1時作用最強，隨后增強作用逐漸降低，說明Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶具有較強地激活作用，最適Mn2+濃度為5.0 mmol·L-1。但是還可以看出，滅活酶液空白的吸光值A(chǔ)0隨著Mn2+濃度的增加一直在增大，那么就有可能是Mn2+與DNS試劑發(fā)生反應(yīng)而造成這一結(jié)果。2.1中果糖與右旋糖酐隨Mn2+濃度變化而變化的異常現(xiàn)象也可能由于Mn2+與DNS試劑產(chǎn)生發(fā)應(yīng)而影響了果糖的測定結(jié)果。

表1 Mn2+對右旋糖酐發(fā)酵液檢測的影響

表2 Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶活力檢測的影響

注：檢測樣品稀釋200倍。

2.3 Mn2+與DNS試劑的反應(yīng)

按照DNS測定還原糖的方法對不同濃度的Mn2+進行反應(yīng)并測定結(jié)果(見表3)，隨著Mn2+濃度的增加吸收值A(chǔ)540也在增加，和果糖與DNS發(fā)應(yīng)的變化趨勢一致，說明Mn2+的確與DNS發(fā)生發(fā)應(yīng)。原因在于，Mn2+在堿性介質(zhì)中很容易被氧化，DNS試劑，除了具有氧化性外，還含有氫氧化鈉而呈堿性。雖然相同量相對應(yīng)吸光值有差，Mn2+的均低于果糖，原因可能在于Mn2+的還原性弱于果糖或者與DNS的反應(yīng)弱于果糖的反應(yīng)。因此在使用DNS測定果糖等還原糖樣品時，需要考慮其是否含有類似于Mn2+等的還原性其他物質(zhì)存在，若有就必須改進方法消除影響。

表3 Mn2+、果糖與DNS試劑的反應(yīng)

2.4 改進方法對右旋糖酐發(fā)酵液檢測

從2.1中可看出Mn2+對Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐無促進作用，且隨Mn2+的增加，抑制作用增強，因此將Mn2+濃度降低進行其對Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐影響實驗，按照1.2.1、1.2.3.1、1.2.3.3及1.2.3.4對發(fā)酵液中的右旋糖酐、果糖和右旋糖酐蔗糖酶進行檢測，Mn2+對Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的影響見表4。果糖和右旋糖酐均隨著培養(yǎng)基中Mn2+濃度的增加而降低，說明Mn2+對Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐具有抑制作用，且濃度越大抑制性越強。發(fā)酵液中右旋糖酐蔗糖酶的活力隨Mn2+濃度的增加，開始上升，隨后降低?？紤]到Mn2+本身和DNS發(fā)生應(yīng)，因此將未經(jīng)Lm-1226培養(yǎng)基作為相應(yīng)Mn2+濃度發(fā)酵液檢測的空白對照，從而消除了Mn2+對果糖檢測結(jié)果的影響，使得果糖和右旋糖酐的變化顯示應(yīng)有的一致性。但是從檢測數(shù)據(jù)的絕對值來看，果糖和右旋糖酐的含量對應(yīng)性存在問題。1 kg蔗糖完全被轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生0.526 kg果糖和0.474右旋糖酐，因此發(fā)酵液中果糖的含量應(yīng)大于右旋糖酐。但是表4數(shù)據(jù)倒掛，果糖含量低于右旋糖酐，說明原因可能還在于果糖的檢測。根本原因仍在于Mn2+的性質(zhì)所致，在Mn2+的鹽溶液中加堿時，可以析出膠狀白色Mn(OH)2沉淀，在空氣中不穩(wěn)定，易被氧化成棕色的Mn(OH)4或MnO(OH)2。

MnSO4+ 2NaHO = Mn(OH)2↓ + Na2SO4

2Mn(OH)2+ O2= 2MnO(OH)2↓

DNS試劑含有氫氧化鈉和氧化劑，Mn2+和DNS一定發(fā)生氧化還原反應(yīng)，但是到底是什么樣的反應(yīng)，僅僅通過540 nm的光吸收值是難以清楚的，因此還需要進一步的工作，繼續(xù)探索Mn2+對DNS測定還原糖的影響。

表4 Mn2+對Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的影響液

3 結(jié)論

在Mn2+對腸膜狀明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的影響研究中出現(xiàn)的果糖和右旋糖酐兩種代謝產(chǎn)物隨Mn2+濃度變化的不一致性而發(fā)現(xiàn)問題；隨后通過Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶作用的影響研究中找處了DNS測定果糖是產(chǎn)生問題的原因；然后通過Mn2+與DNS的發(fā)應(yīng)進一步證實，Mn2+本身的氧化還原型性導(dǎo)致其與DNS試劑產(chǎn)生反應(yīng)，在測定果糖時要考慮到Mn2+對檢測結(jié)果的影響；最后通過檢測時以含有Mn2+的培養(yǎng)基作為相對應(yīng)發(fā)酵液的空白對照，檢測結(jié)果表明，克服了果糖和右旋糖酐兩種代謝產(chǎn)物隨Mn2+濃度變化的不一致性的問題，但是從Mn2m-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的轉(zhuǎn)化機理的角度來看，檢測結(jié)果中的果糖含量和右旋糖酐產(chǎn)出量出現(xiàn)了倒掛現(xiàn)象，說明僅僅通過改變檢測空白來消除Mn2+對果糖檢測的影響還遠遠不夠，畢竟沒有搞清楚在發(fā)酵液中的果糖與DNS發(fā)應(yīng)的同時Mn2y與DNS到底發(fā)生了什么樣的發(fā)應(yīng)，還需要進一步的工作?？傊?，Mn2+對DNS法測定右旋糖酐發(fā)酵液中的果糖含量有影響，需要在利用DNS法測定樣品中的還原糖時，一定要考慮是否含有具有氧化還原性的其他成分，若有就需要改進方法，消除其對檢測結(jié)果的影響。