降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究

郭俊峰 張慧宇 張綱 安洋 楊陽(yáng) 王飛 譚穎徽

第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400037

降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究

郭俊峰 張慧宇 張綱 安洋 楊陽(yáng) 王飛 譚穎徽

第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400037

目的 探討降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。方法 1）構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，將實(shí)驗(yàn)分為4組，H2O2組使用含不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol·L-1）H2O2的培養(yǎng)液，CGRP+H2O2組使用含不同濃度（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol·L-1）CGRP的培養(yǎng)液預(yù)處理后再加入含

降鈣素基因相關(guān)肽； 成骨細(xì)胞； 氧化損傷； 超氧化物歧化酶； 活性氧

頜面部的創(chuàng)傷和骨折在現(xiàn)代社會(huì)中很常見[1]。骨創(chuàng)傷愈合本身是一個(gè)受多種因子、信號(hào)、激素等精密調(diào)控的復(fù)雜的生理過程。其中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生在骨折的發(fā)生及修復(fù)過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[2]。真核細(xì)胞在正常代謝中均能產(chǎn)生ROS[3]；但過剩的ROS所造成的氧化應(yīng)激反而會(huì)導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生。過氧化氫（H2O2）是主要的活性氧之一，能穿透生物膜導(dǎo)致細(xì)胞的膨脹破裂，損傷線粒體，造成細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的功能異常，從而對(duì)宿主細(xì)胞造成廣泛性的傷害。研究[4]表明，骨折發(fā)生時(shí)不僅會(huì)釋放大量的炎癥介質(zhì)，同時(shí)組織內(nèi)的ROS水平也會(huì)顯著增高；骨細(xì)胞在這樣的環(huán)境下功能會(huì)受到損傷，這也將嚴(yán)重影響骨的修復(fù)與愈合。

研究[5]證實(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)參與骨重塑。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）作為骨組織中分布最為廣泛的神經(jīng)肽，被認(rèn)為是骨的天然活化劑，它的潛在治療作用越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注。CGRP是由特定神經(jīng)元的可變剪接生成的37個(gè)氨基酸所組成的[6]，其受體屬于G蛋白偶聯(lián)家族成員。骨創(chuàng)傷后，在創(chuàng)傷周圍的末梢神經(jīng)會(huì)分泌大量CGRP顆粒，且與其他神經(jīng)肽類物質(zhì)參與損傷修復(fù)和組織重建[7]。在體外實(shí)驗(yàn)中，CGRP不僅能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)還能抑制破骨細(xì)胞的增殖；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CGRP能促進(jìn)骨折或者其他外傷的愈合。此外，CGRP還能抑制成骨細(xì)胞的凋亡[8]。通過這些結(jié)果，筆者推測(cè)CGRP對(duì)成骨細(xì)胞具有潛在的保護(hù)作用，那么在成骨細(xì)胞受到氧化損傷的過程中，CGRP是否還能夠?qū)Τ晒羌?xì)胞的生物學(xué)活性起到積極的作用呢？本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行研究，觀察CGRP對(duì)H2O2刺激下MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響，以及CGRP對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，旨在進(jìn)一步了解骨創(chuàng)傷愈合機(jī)制以及CGRP在其中扮演的重要角色，以期為今后治療頜骨骨創(chuàng)傷提供新的思路和方向。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

MC3T3-E1成骨細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；MEMα培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)），PBS緩沖液干粉（武漢博士德生物工程有限公司），30%過氧化氫（重慶川東化工集團(tuán)有限公司）、CGRP（Sigma公司，美國(guó)）、CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、ROS測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6定量分析酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海巧伊生物科技有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)采用第3代MC3T3-E1 成骨細(xì)胞。

1.2 構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型及CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1成骨細(xì)胞以5×103個(gè)·mL-1的密度接種于96孔板內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞充分貼壁后隨機(jī)分組處理。實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組，H2O2組，CGRP+H2O2組，空白組。每組設(shè)3個(gè)平行孔。H2O2組：又分為5個(gè)小組，分別加入含不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol·L-1）H2O2的培養(yǎng)液100 μL；CGRP+H2O2組：又分為5個(gè)小組，分別使用含不同濃度（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol·L-1）CGRP的培養(yǎng)液100 μL預(yù)處理1 h，再加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液100 μL；對(duì)照組：加入常規(guī)培養(yǎng)液100 μL；空白組：用于調(diào)零，不接種細(xì)胞，僅加入常規(guī)培養(yǎng)液100 μL。將96孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h后棄去上清液，每孔加入10 μL CCK-8溶液和90 μL PBS緩沖液，輕微振蕩混勻后繼續(xù)孵育1 h，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，篩選最佳建模濃度和CGRP對(duì)成骨細(xì)胞氧化損傷的最佳保護(hù)濃度。

1.3 SOD活性測(cè)定

將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為每孔3×106個(gè)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞充分貼壁。實(shí)驗(yàn)分為4組，CGRP+ H2O2組使用含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液1 mL預(yù)處理1 h，然后再加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液1 mL；H2O2組中加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液2 mL；CGRP組中加入含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液2 mL；對(duì)照組中加入常規(guī)培養(yǎng)液2 mL。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，按SOD測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4 ELISA法檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平

將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為每孔3×106個(gè)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞充分貼壁。實(shí)驗(yàn)分為4組，CGRP+H2O2組使用含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液1 mL預(yù)處理1 h，然后再加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液1 mL；H2O2組中加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液2 mL；CGRP組中加入含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液2 mL；對(duì)照組中加入常規(guī)培養(yǎng)液2 mL。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6定量分析ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 ROS含量的測(cè)定

將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為每孔3×106個(gè)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞充分貼壁。實(shí)驗(yàn)分為4組，CGRP+H2O2組使用含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液1 mL預(yù)處理1 h，然后再加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液1 mL；H2O2組中加入含10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液2 mL；CGRP組中加入含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液2 mL；對(duì)照組中加入常規(guī)培養(yǎng)液2 mL。培養(yǎng)48 h后，按ROS測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖活性

各組的細(xì)胞增殖活性見圖1、2。

圖1 H2O2對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effects of H2O2on MC3T3-E1 osteoblasts proliferation

1）MC3T3-E1成骨細(xì)胞在不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol·L-1）H2O2下培養(yǎng)12～48 h，細(xì)胞增殖活性在10-4mol·L-1H2O2時(shí)開始出現(xiàn)抑制（P＜0.01），并隨著濃度的增加和時(shí)間的后移，呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性（圖1）；2）MC3T3-E1成骨細(xì)胞在不同濃度（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol·L-1）CGRP的培養(yǎng)液預(yù)處理后，10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)液中細(xì)胞增殖活性最高，與只加入10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）（圖2），提示10-8mol·L-1CGRP具有明顯的抗氧化損傷的作用，對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖2 CGRP對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effects of CGRP on MC3T3-E1 osteoblasts proliferation

2.2 細(xì)胞SOD活性

與對(duì)照組相比，CGRP組、CGRP+H2O2組SOD活性升高（P＜0.05），H2O2組SOD活性降低（P＜0.05）。CGRP+H2O2組SOD活性高于H2O2組（P＜0.01）（圖3）。提示：CGRP在一定程度上可以降低H2O2對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞SOD活性的抑制作用。

圖3 各組成骨細(xì)胞SOD活性的影響Fig 3 Osteoblasts activity of SOD of every group

2.3 TNF-α、IL-1β、IL-6的水平

各組的TNF-α、IL-1β、IL-6水平見圖4。H2O2組TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于對(duì)照組（P＜0.01）；CGRP+H2O2組TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于H2O2組（P＜0.05）。提示：CGRP的抗炎效應(yīng)在MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮了一定的保護(hù)作用。

圖4 各組TNF-α、IL-1β、IL-6的水平Fig 4 TNF-α、IL-1β、IL-6 level of every group

2.4 ROS含量

CGRP+H2O2組、H2O2組、CGRP組、對(duì)照組的ROS含量分別為22.2%、32.6%、3.5%、11.0%。H2O2組ROS含量高于對(duì)照組（P＜0.01），CGRP+H2O2組ROS含量低于H2O2組（P＜0.01）。提示：CGRP具有抗氧化作用，其能抑制H2O2對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞造成的氧化損傷。

3 討論

骨的生理功能主要依賴骨重建的動(dòng)態(tài)平衡。骨的生理活動(dòng)取決于成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收之間的平衡，任何影響或者破壞骨重建平衡的因素均會(huì)導(dǎo)致骨代謝性疾病。成骨細(xì)胞是骨重建的重要細(xì)胞，它的質(zhì)量與數(shù)量將決定基質(zhì)的分泌，影響破骨細(xì)胞的功能。氧化應(yīng)激是由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS或者是機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制受損所引起，現(xiàn)已證實(shí)氧化應(yīng)激對(duì)骨代謝有重要的影響[9-11]。骨折的過程中伴隨著ROS的升高，直接會(huì)影響到骨修復(fù)。此外，H2O2會(huì)對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞造成氧化損傷，不僅體現(xiàn)在細(xì)胞會(huì)失去原有的形態(tài)，成骨細(xì)胞增殖也會(huì)受到明顯的抑制。

CGRP作為重要的感覺神經(jīng)遞質(zhì)，被證明在頜骨創(chuàng)傷修復(fù)、骨重建過程中發(fā)揮著重要作用[12]。本課題前期研究[5]證實(shí)，CGRP在下頜骨骨折愈合中的修復(fù)作用，有一部分是通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)的。筆者推測(cè)，在頜骨損傷的修復(fù)機(jī)制中是否也存在一部分是依賴于CGRP抗氧化損傷的保護(hù)機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的呢？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CGRP可以逆轉(zhuǎn)H2O2對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的抑制，并篩選了最優(yōu)勢(shì)濃度。此外，本研究結(jié)果還表明，CGRP能夠恢復(fù)H2O2對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞SOD活性的抑制。分析CGRP這種發(fā)揮抗氧化作用所涉及的機(jī)制，筆者認(rèn)為，可能是因?yàn)镃GRP增強(qiáng)了MC3T3-E1成骨細(xì)胞在H2O2下被抑制的SOD活性，SOD本身能夠清除MC3T3-E1成骨細(xì)胞因氧化損傷所產(chǎn)生的過量的超氧化物如ROS；ROS量的減少又可以改善MC3T3-E1成骨細(xì)胞的細(xì)胞活性，從而促進(jìn)骨折的愈合。

近來(lái)，也有研究報(bào)道CGRP還具有抗炎的潛能。CGRP能夠抑制在內(nèi)毒素刺激下炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放，通過減少炎癥反應(yīng)，抑制成骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞活化從而促進(jìn)骨折愈合[8,13]，這些結(jié)果也是CGRP積極參與骨修復(fù)的有力證據(jù)。在H2O2作用下，成骨細(xì)胞產(chǎn)生的ROS增多，ROS通過刺激破骨細(xì)胞釋放TNF-α等炎癥因子間接影響到成骨細(xì)胞的活性與增殖，進(jìn)而影響骨折的愈合。

不論如何，CGRP可以減輕H2O2對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞SOD的負(fù)性影響，改善MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖活性，能對(duì)氧化損傷下的MC3T3-E1成骨細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，這一點(diǎn)是比較明確的。相關(guān)的研究還在繼續(xù)，我們?cè)谙乱徊降膶?shí)驗(yàn)中將會(huì)進(jìn)一步揭示這種保護(hù)作用所涉及的信號(hào)分子及機(jī)制，以期為CGRP促進(jìn)頜面部骨創(chuàng)傷的愈合提供新的靶點(diǎn)和依據(jù)。

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（本文采編 李彩）

Protective effect of calcitonin gene-related peptide against oxidative damage in MC3T3-E1 osteoblasts

Guo Junfeng, Zhang Huiyu, Zhang Gang, An Yang, Yang Yang, Wang Fei, Tan Yinghui. (Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81371110). Correspondence: Tan Yinghui, E-mail: tanyhxqkq@163.com.

Objective This study aimed to observe the protective effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP), as well as its potential mechanism, against oxidative damage in MC3T3-E1 osteoblasts. Methods 1) MC3T3-E1 osteoblasts were treated with different hydrogen peroxide (H2O2) concentrations (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, and 10-5mol·L-1) for 12, 24, 36, and 48 h to build an oxidative damage model, to determine cell proliferation activity in each group by using CCK-8 assay, and to determine the optimal modeling concentration. MC3T3-E1 osteoblasts were pretreated for 1 h with different CGRP concentrations (10-6, 10-7, 10-8, 10-9, and 10-10mol·L-1) followed by treatment with H2O2(10-4mol·L-1). After 12, 24, 36, and 48 h, the CGRP expression and activity of osteoblasts were detected using the CCK-8 method to determine the optimal CGRP concentration that provides the best protective effect against oxidative damage. 2) Superoxide dismutase (SOD) activity, reactive oxygen species (ROS) content, and the levels of the inflammatory cytokines tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, and IL-6 of the groups treated with CGRP, H2O2, CGRP+H2O2were determined. Results 1) Compared with the control group, treatment with 10-4mol·L-1H2O2significantly started to inhibite the proliferation of osteoblasts (P＜0.01) in a dose- and timedependent manner. Compared with 10-4mol·L-1H2O2group, pretreatment with 10-8mol·L-1CGRP significantly increased the proliferation of osteoblasts (P＜0.01). 2) Compared with H2O2group, CGRP+H2O2group significantly increased theSOD activity (P＜0.01), ROS content significantly decreased (P＜0.01), TNF-α, IL-1β, and IL-6 secretion significantly decreased (P＜0.05). Conclusion H2O2can cause oxidative damage to MC3T3-E1 osteoblasts, whereas CGRP exerts protective effect against oxidative damage in MC3T3-E1 osteoblasts.

calcitonin gene-related peptide; osteoblasts; oxidative damage; superoxide dismutase; reactive oxygen species

R 782.4

A

10.7518/hxkq.2016.06.007

2016-02-16；

2016-06-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助（81371110）

郭俊峰，碩士，E-mail：guojfkq@163.com

譚穎徽，教授，博士，E-mail：tanyhxqkq@163.com

10-4mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液，對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)液，空白組不接種細(xì)胞。培養(yǎng)12、24、36、48 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，篩選最佳建模濃度和CGRP對(duì)成骨細(xì)胞氧化損傷的最佳保護(hù)濃度。2）采用含10-4mol·L-1H2O2（H2O2組）、10-8mol·L-1CGRP（CGRP組）的培養(yǎng)液和10-8mol·L-1CGRP+10-4mol·L-1H2O2培養(yǎng)液（CGRP+H2O2組）、常規(guī)培養(yǎng)液（對(duì)照組）培養(yǎng)成骨細(xì)胞，測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）的活性、活性氧（ROS）的含量以及炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6的水平。結(jié)果 1）在10-4mol·L-1H2O2時(shí)細(xì)胞增殖開始出現(xiàn)抑制（P＜0.01），并呈濃度和時(shí)間依賴性；10-8mol·L-1CGRP預(yù)處理后細(xì)胞增殖活性最高，與只加入10-4mol·L-1H2O2有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。2）與H2O2組相比，CGRP+H2O2組SOD活性升高（P＜0.01），TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05），ROS含量降低（P＜0.01）。結(jié)論 H2O2會(huì)對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞造成氧化損傷，CGRP對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。