盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥大鼠腸黏膜通透性改變與TNF-α表達水平的關(guān)系*

許雄，陳建新，陳瑞媛，徐剛，石燕青，張森

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021

膿毒癥是由感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，在全球范圍內(nèi)伴有高發(fā)病率及死亡率，易導(dǎo)致多器官損傷和功能障礙，應(yīng)引起足夠的重視［1］。有觀點認為，在多器官功能障礙中，腸道是炎癥反應(yīng)的啟動器官，同時也是最易受損的器官之一，損傷后其防御性屏障功能減弱，腸黏膜通透性增加，可引發(fā)腸道內(nèi)細菌和內(nèi)毒素易位，導(dǎo)致促炎性介質(zhì)和抑炎性介質(zhì)平衡失調(diào)，造成惡性循環(huán)，進一步加重組織器官的損害［2］。

二胺氧化酶（diamineoxidase，DAO）是一種有較高活性的細胞內(nèi)酶，主要存在于人類和哺乳動物的小腸黏膜和纖毛上皮細胞中，其活性與絨毛高度及黏膜細胞核酸蛋白合成密切相關(guān)，其中空、回腸部的活性最高［3］。有研究表明，腸黏膜細胞受損、壞死可引起腸黏膜二胺氧化酶表達水平的降低和血清二胺氧化酶表達水平的增高［4-5］，該酶釋放入血的主要途徑是透過腸黏膜屏障，因此測定血中二胺氧化酶的水平可一定程度反映腸黏膜通透性的變化情況，而膿毒癥過程中腸黏膜受損引起腸黏膜通透性改變的相關(guān)機制目前尚不完全清楚。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作為最重要的早期促炎因子之一，在機體炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著較為關(guān)鍵的作用，可能在該過程中扮演了重要角色［6］。故本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）方法制作腹腔感染膿毒癥模型，并觀察膿毒癥大鼠初期血清二胺氧化酶（DAO）、血清TNF-α表達水平及回腸黏膜組織病理的情況，以探討膿毒癥大鼠早期腸黏膜通透性改變與血清TNF-α水平的可能關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取48只健康雄性SD大鼠為研究對象，大鼠7～9周齡、體質(zhì)量（270.00±30.00）g，為清潔級（specified pathogen free，SPF），購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心。所有大鼠實驗前均在廣西醫(yī)科大學動物中心SPF級飼養(yǎng)房適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w（室溫控制在25℃左右，空氣濕度控制在50%左右，每日光照12 h，大鼠皆自由飲食飲水）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及造模 將48只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n=24）與CLP組（n=24）。根據(jù)術(shù)后取材的時間點（分別為術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h），進一步將假手術(shù)組和CLP手術(shù)組兩組隨機各分為術(shù)后6 h組、術(shù)后12 h組、術(shù)后24 h組、術(shù)后48 h組四個亞組（每個時間點各6只），共計8個亞組。本研究參照課題組前期盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)操作經(jīng)驗，制作腹腔感染膿毒癥模型［7］。假手術(shù)組和CLP模型組均在CLP術(shù)前12 h禁食、6 h前禁飲。造模的具體步驟如下：按大鼠體重以0.60 mL/100 g的5%水合氯醛溶液進行腹腔注射，待大鼠癱軟后檢查麻醉效果，用鑷子鉗夾下肢皮膚，當四肢無反應(yīng)、呼吸淺慢有節(jié)律時即可認為麻醉成功。麻醉后，模型組以腹正中行1.5 cm縱形切口，逐層進入腹腔，找到盲腸，小心分離盲腸系膜，注意避免損傷回盲腸血管及接觸腹部皮膚和毛發(fā)，將盲腸內(nèi)容物輕輕擠向盲腸游離末端，在盲腸中段部位處用4-0絲線結(jié)扎，在已結(jié)扎盲腸與盲腸末端中間部位用21G針頭貫通穿刺，移去針頭后適當擠壓少量腸內(nèi)容物從兩側(cè)針孔溢出，小心將盲腸還納至腹腔內(nèi)，注意腸管不要接觸到皮膚切口，并分層縫合腹壁切口；假手術(shù)組僅行剖腹手術(shù)，稍翻動腸管后立即關(guān)腹。術(shù)畢按大鼠體重3 mL/100 g予以皮下注射提前已預(yù)熱至37℃的生理鹽水，并由電烤燈供暖直至大鼠蘇醒。蘇醒后的各組大鼠送入動物房常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 大鼠造模后一般狀況觀察 分別觀察假手術(shù)組和CLP組兩組中各亞組大鼠的外觀、活躍度、飲食狀況等，并及時記錄各組大鼠存活情況。

1.2.3 血液標本的采集及檢測 在各組大鼠對應(yīng)的取材時間節(jié)點上，使用與造模時相同的麻醉方法將大鼠麻醉，沿原手術(shù)切口打開腹腔，無菌紗布小心撥開腸管及腹膜組織，暴露腹主動脈，用一次性采血針在腹主動脈處穿刺取血3～5 mL，推入EDTA抗凝的試管中，室溫下離心分離血清，分裝于EP管中并標記，-70℃低溫冰箱保存待檢。使用ELISA試劑盒（購自武漢華美生物公司）檢測假手術(shù)組和模型組大鼠不同時間點血清TNF-α、二胺氧化酶水平。

1.2.4 回腸黏膜組織學觀察 每只大鼠在采血完成后立即距回盲部10 cm左右處取一段長2～3 cm的回腸組織，采用10%甲醛固定3 h，石蠟包埋，HE染色，病理顯微鏡下觀察回腸黏膜形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行分析。符合正態(tài)分布計量資料采用（xˉ±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況及腹腔炎癥情況

本研究中各組SD大鼠在各取材時間點前未發(fā)現(xiàn)有死亡情況。假手術(shù)組大鼠活躍、飲食正常、被毛柔順、無豎毛戰(zhàn)栗情況，腹腔內(nèi)小腸腸管無明顯充血水腫等炎性表現(xiàn)（圖1A）。造模組大鼠術(shù)后逐漸出現(xiàn)蜷縮在籠角、毛發(fā)豎立、渾身戰(zhàn)栗、食欲減退等情況，腹腔內(nèi)可見：造模6 h組可見小部分腸管擴張充氣，充血滲出不明顯；造模12 h組可見腸管水腫擴張明顯，腹腔少量滲出液（圖1B）；24 h組可見腸管充血水腫嚴重，內(nèi)臟粘連嚴重及部分腸管發(fā)黑壞死，腹膜包裹呈局限狀，表面膿性及血性滲出液較多（圖1C）；48 h組可見腸管粘連進一步加重，腹腔血性滲出相對24 h組有所減輕（圖1D）。

2.2 大鼠血清TNF-α水平

假手術(shù)組大鼠在術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h時血清TNF-α表達水平之間的差異無統(tǒng)計學意義（F=1.609，P=0.219）；CLP造模大鼠血清TNF-α表達水平在術(shù)后6 h時高于假手術(shù)組，后呈上升趨勢，在術(shù)后12 h左右達到峰值，隨后呈下降趨勢，CLP組與假手術(shù)組在術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h四個時間點時血清TNF-α表達水平之間的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表1。

2.3 大鼠血清DAO水平

假手術(shù)組大鼠術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h四個時間點的血清DAO表達水平之間的差異無統(tǒng)計學意義（F=0.467，P=0.709）；CLP組大鼠血清DAO含量隨時間推移呈升高趨勢，與假手術(shù)組在術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h四個時間點時表達水平之間的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

圖1 大鼠腹腔炎癥情況

表1 大鼠血清TNF-α表達水平（pg/mL，xˉ±s）

表2 大鼠血清DAO表達水平（U/mL，xˉ±s）

2.4 腸黏膜組織病理學改變

假手術(shù)組腸黏膜上皮完整，腺體排列整齊，無或僅有少量炎癥細胞浸潤（圖2A），而CLP組大鼠回腸黏膜有較為明顯的病理改變：術(shù)后12 h組開始出現(xiàn)腸黏膜和黏膜下層間質(zhì)水腫及血管充血，黏膜層有部分中性粒細胞浸潤（圖2B）；24 h組腸絨毛明顯排列紊亂，高矮不一，部分倒伏、融合，黏膜上皮糜爛缺失，部分固有層內(nèi)腺體灶性區(qū)域壞死和隱窩膿腫形成（圖2C）；48 h組仍可見黏膜水腫、充血及炎細胞浸潤，但黏膜上皮脫落較24 h組減少（圖2D）。

圖2 大鼠回腸黏膜組織形態(tài)學觀察（HE，×100）

3 討論

腸黏膜屏障是指阻隔腸腔內(nèi)致病菌、毒素等跨越腸黏膜至血液循環(huán)和外周重要組織臟器結(jié)構(gòu)及功能的總和，主要由機械屏障、化學屏障、生物屏障和免疫屏障四部分構(gòu)成，是機體屏障系統(tǒng)的重要組成部分［8］。其中，由腸黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接等構(gòu)成的機械屏障是關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［9］。當腸黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接等結(jié)構(gòu)破壞時，腸黏膜的通透性會顯著增加，除致病菌、毒素等物質(zhì)外，腸腔內(nèi)容物及腸黏膜分泌的黏液和蛋白等亦能跨越腸屏障進入血液和組織［10］。

本研究中，血清TNF-α水平在盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后6 h起即高于假手術(shù)組，此后短時間內(nèi)迅速升高，在術(shù)后12 h左右達到峰值，隨后呈下降趨勢，在術(shù)后24 h時仍維持在高濃度水平，在術(shù)后48 h仍高于假術(shù)組。目前相關(guān)研究已表明在腸道局部炎癥引起腸組織細胞損害的早期，腸道巨噬細胞和中性粒細胞可產(chǎn)生大量TNF-α，其一方面是IL-1、IL-6等其他因子的激動劑，另一方面可促使內(nèi)皮細胞、中性粒細胞等相互之間的移行、黏附，致產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)大量增加，形成瀑布連鎖效應(yīng)，加重腸組織細胞的損傷［11-12］。在炎癥后期血清TNF-α的表達水平呈下降趨勢可能與抑炎因子的釋放增多引起免疫抑制有關(guān)［13］。有研究報道在大鼠腹腔注射脂多糖制造內(nèi)毒素休克模型中應(yīng)用TNF-α、IL-6等炎性因子拮抗劑可明顯減輕腸黏膜損傷程度［14-15］，提示在膿毒癥中血清TNF-α水平的高低與腸黏膜損傷有關(guān)。

哺乳綱生物約95%的DAO存在小腸腸黏膜，另一部分約5%存在胎膜和腎臟組織器官［16］。相關(guān)文獻也已報道DAO表達水平與腸道黏膜上層和固有層細胞內(nèi)的脫氧核糖核酸合成、核糖核酸合成和氨基酸脫水縮合呈現(xiàn)緊密關(guān)聯(lián)性［17］。因此認為，血清中DAO表達水平的高低可作為本研究中腸黏膜損傷程度及通透性改變的一個參考指標。本研究結(jié)果提示，相比于假手術(shù)組，CLP組術(shù)后6 h左右大鼠血清DAO表達水平即有升高，后隨時間的推移而有升高趨勢，至術(shù)后48 h時，其血清DAO表達水平均高于同時間點的假手術(shù)組。結(jié)合大鼠一般狀態(tài)、腹腔內(nèi)器官病變情況及回腸黏膜組織切片的病理學改變分析，提示在膿毒癥病程中腸道黏膜損傷的持續(xù)加重可能導(dǎo)致腸黏膜通透性呈增加趨勢，而腸黏膜和纖毛上皮細胞中的DAO透過破壞的腸黏膜屏障釋放入血，引起血清DAO水平的升高。

綜上所述，大鼠在盲腸結(jié)扎穿孔致膿毒癥狀態(tài)下可出現(xiàn)血清早期促炎因子TNF-α表達水平的升高，同時伴有血清DAO的變化及回腸腸黏膜病理改變，可以初步推斷盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥中TNF-α等促炎因子釋放引發(fā)的炎癥反應(yīng)可能與腸黏膜通透性改變有關(guān)，但具體機制有待進一步的探索。