VDR（Fo KI）基因多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎易感性的關(guān)系分析

黃濤，劉春慶，趙磊

北京市大興區(qū)人民醫(yī)院普外科 北京 102600

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的腸道非特異性炎癥，其容易反復(fù)發(fā)作、病程較長，部分患者還可能會發(fā)生癌變［1-2］。維生素D受體作為核受體家族成員之一，它通過與維生素D相結(jié)合，再通過結(jié)合靶器官從而在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能［3］。編碼維生素D受體的基因起始密碼子區(qū)域表現(xiàn)為FokI基因多態(tài)性，該基因多態(tài)性是影響維生素D受體（VDR）發(fā)揮生物學(xué)功能唯一位點(diǎn)，同時與其他位點(diǎn)無交叉作用［4-5］。既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)okI基因多態(tài)性與Graves病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等多個疾病的易感性相關(guān)［5-7］，并且有研究報道稱維生素D的缺乏可能是潰瘍性結(jié)腸炎病情加重的重要原因［8］。1,25-(OH)2D3是維生素D3的活性代謝產(chǎn)物，其不僅和機(jī)體鈣代謝有關(guān)，同時還參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡［9-10］，而血清25(OH)D含量是反應(yīng)機(jī)體維生素D水平的重要指標(biāo)［11］。目前關(guān)于FokI基因多態(tài)性、維生素D水平及潰瘍性結(jié)腸炎三者關(guān)系的報道比較少。因此本研究檢測潰瘍性結(jié)腸炎患者維生素D受體FokI基因多態(tài)性及血清25(OH)D水平，探討其與潰瘍性結(jié)腸炎易感性的關(guān)系，旨在為潰瘍性結(jié)腸炎的診治提供一定的參考依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月至2016年10月期間在本院就診的78例潰瘍性結(jié)腸炎患者作為觀察組，同期選擇本院體檢中心90例健康體檢者作為對照組。潰瘍性結(jié)腸炎患者根據(jù)其結(jié)腸鏡結(jié)果分為廣泛型（n=38）和遠(yuǎn)端型（n=40）；疾病的嚴(yán)重程度按照改良Truelove Witts標(biāo)準(zhǔn)［12］進(jìn)行分型，分為輕度（n=18）、中度（n=32）、重度（n=28）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。兩組一般資料對比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料對比

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）觀察組：①年齡18～70歲；②按照中國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識進(jìn)行診斷［12］，經(jīng)病理確診為潰瘍性結(jié)腸炎；③近6個月內(nèi)未服用過維生素D及相關(guān)制品；④自愿并同意參加此次研究，并能夠配合完成該研究。（2）對照組：①年齡18～70歲；②體檢及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果正常者；③自愿參加本研究，依從性較好，配合完成該項(xiàng)研究。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）合并嚴(yán)重的心、肝、腎功能障礙等疾病；（2）伴有癲癇、精神疾病等情況；（3）認(rèn)知功能障礙；（4）參加本研究前4 w內(nèi)參加過其他臨床試驗(yàn)。

1.3 主要試劑

血液基因組DNA試劑盒（DP318-02）、PCR反應(yīng)試劑盒(KT121221)、PCR純化試劑盒均為北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品，F(xiàn)okI上下游引物由深圳華大基因公司合成，用于檢測25(OH)D的ELISA試劑盒購自江蘇科晶生物科技有限公司。

1.4 血樣采集

使用一次性真空抗凝采血管采集患者空腹靜脈血2 mL，用于血液基因組DNA提取；另使用一次性真空非抗凝采血管采集空腹靜脈血3 mL，室溫下放置30 min后4000 g進(jìn)行離心，離心時間15 min，將血清分離放置于另一個干凈的EP管中，于-20°C保存?zhèn)溆?，用于血?5(OH)D水平的檢測。

1.5 FokI基因多態(tài)性的檢測

按照血液基因組DNA試劑盒的操作方法提取全基因組DNA，并進(jìn)行稀釋（按10倍稀釋），于-20°C保存?zhèn)溆谩＿\(yùn)用Primer 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由深圳華大基因公司合成。FokI和內(nèi)參GAPDH引物見表2。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表3，進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得PCR產(chǎn)物，按照PCR純化試劑盒說明書的操作步驟對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化（純度要求：OD260/OD280約為1.8），PCR純化產(chǎn)物送至深圳華大基因公司進(jìn)行測序，將測序數(shù)據(jù)運(yùn)用GeneMapper 5.0軟件進(jìn)行基因型的判讀。

1.6 血清25(OH)D水平的檢測

取出備存血清，按照25(OH)D的ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟檢測兩組研究對象血清25(OH)D水平。

表2 各個基因的上下游引物

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用（xˉ±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用［n(%)］表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組VDR（FokI）等位基因和基因型頻率分布

兩組FokI位點(diǎn)的基因型分布滿足Hardy-Weinberg平衡定律。觀察組（C）等位基因突變頻率低于對照組，（TC+CC）基因型頻率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表4。

2.2 不同病變范圍、嚴(yán)重程度患者VDR（FokI）基因多態(tài)性比較

不同病變范圍、嚴(yán)重程度患者VDR（FokI）等位基因和基因型頻率分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表5。

2.3 兩組血清25(OH)D水平對比

觀察組血清25(OH)D水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），其中對照組、觀察組血清25(OH)D水平≤30μg的比例分別為35.56%、51.28%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表4 兩組VDR（FokI）等位基因和基因型頻率分布［n(%)］

表5 不同病變范圍、嚴(yán)重程度患者VDR（FokI）基因多態(tài)性比較［n(%)］

表6 兩組血清25(OH)D水平對比

3 討論

維生素D作為體內(nèi)一類脂溶性類固醇激素，其主要包括VitD2和VitD3，兩者在體內(nèi)均無生物性活性，經(jīng)機(jī)體吸收后在腎臟和肝臟部位經(jīng)過轉(zhuǎn)化生成1,25-(OH)2D3，然后與VDR相結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)功能［13-14］。維生素D是機(jī)體參與鈣磷代謝的關(guān)鍵激素之一，同時與機(jī)體多個組織器官與系統(tǒng)的生理功能密切相關(guān)［15-16］。已有研究報道潰瘍性結(jié)腸炎與VDR（FokI）基因多態(tài)性的關(guān)系，F(xiàn)arnood等［17］發(fā)現(xiàn)，在伊朗人群中，潰瘍性結(jié)腸炎患者FokI位點(diǎn)的等位基因（C）突變頻率低于健康對照組，而Hughes等［18］發(fā)現(xiàn)在高加索白種人群中潰瘍性結(jié)腸炎的易感性與FokI位點(diǎn)基因突變無關(guān)，這些研究結(jié)果表明不同種族人群的遺傳背景不同，VDR（FokI）基因多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎的易感性也不同。

本研究選取我國漢族人群中潰瘍性結(jié)腸炎患者和健康者作為研究對象，通過比較兩組VDR（FokI）等位基因和基因型頻率分布，結(jié)果顯示，觀察組（C）等位基因突變頻率低于對照組，（TC+CC）基因型頻率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示VDR（FokI）位點(diǎn)（C）等位基因突變可能降低潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生風(fēng)險。同時檢測不同病變范圍、嚴(yán)重程度患者潰瘍性結(jié)腸炎患者VDR（FokI）等位基因及基因型頻率分布，結(jié)果顯示，不同病變范圍、嚴(yán)重程度潰瘍性結(jié)腸炎患者VDR（FokI）等位基因及基因型頻率分布比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），說明VDR（FokI）基因突變可能與潰瘍性結(jié)腸炎病變范圍及嚴(yán)重程度無關(guān)。

此外，本研究比較了潰瘍性結(jié)腸炎患者與健康者血清25(OH)D水平的差異，結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎患者血清25(OH)D水平低于對照組，且觀察組血清25(OH)D水平≤30μg的患者比例（51.28%）高于健康者（35.56%），與Rodrigues等［19］的報道印度人群血清25(OH)D水平基本相符，25(OH)D水平≤30 μg的比例則高于Jahnsen等［20］報道的高加索人群的15.0%。推測導(dǎo)致上述研究結(jié)果差異的原因可能是影響機(jī)體維生素D水平并非單一因素，其他因素如氣候、季節(jié)、飲食結(jié)構(gòu)、遺傳因素等均與維生素D水平調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述，VDR（FokI）基因突變可能降低潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病風(fēng)險，但未見與疾病的嚴(yán)重程度和病變范圍有關(guān)，且潰瘍性結(jié)腸炎患者血清25(OH)D水平普遍降低。