巴氏殺菌和超巴氏殺菌對牛乳清蛋白結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性的影響

王喜波，張安琪，王玉瑩，崔 強(qiáng)，周國衛(wèi)，王 琳

?

巴氏殺菌和超巴氏殺菌對牛乳清蛋白結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性的影響

王喜波，張安琪，王玉瑩，崔 強(qiáng)，周國衛(wèi)，王 琳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

為了研究巴氏殺菌與超巴氏殺菌處理對牛乳清蛋白結(jié)構(gòu)的影響，采用熱力學(xué)和光譜學(xué)等方法測定乳清蛋白結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性。紅外光譜分析結(jié)果顯示巴氏殺菌處理對乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)影響不顯著，而經(jīng)超巴氏殺菌處理后的乳清蛋白中-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著減少，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量顯著增多，結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的更為無序，其穩(wěn)定性更好；熒光光譜分析結(jié)構(gòu)表明經(jīng)121 ℃、5 s超巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品發(fā)生紅移，說明超巴氏殺菌改變了乳清蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)；差示掃描量熱法分析結(jié)果顯示121 ℃、5 s熱處理的乳清蛋白樣品熱變性溫度為99.9 ℃，高于巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品，表明超巴氏殺菌處理后的乳清蛋白樣品的穩(wěn)定性顯著提高，期望為制備高品質(zhì)乳提供理論基礎(chǔ)。

熱處理；結(jié)構(gòu)分析；熱性能；巴氏殺菌；超巴氏殺菌；乳清蛋白

0 引 言

牛乳中乳清蛋白較酪蛋白對熱處理更敏感、更易發(fā)生變性，牛乳在加工過程中通常采用熱處理控制微生物生長。國內(nèi)外常用的巴氏殺菌方法主要有2種[1]：第一種方法是將原料乳加熱到62～65 ℃，持續(xù)30 min，稱低溫長時滅菌法，能夠殺滅原料乳中生長型致病菌，滅菌率高達(dá)97.3%～99.9%[2]；第二種方法是將牛乳加熱到72～85 ℃，持續(xù)15 s，稱高溫短時滅菌法，能夠?qū)⑷康牟≡⑸餁⑺?，但是也會造成少量營養(yǎng)成分的損失以及風(fēng)味的改變[3]。還有一種熱處理方法被稱為超巴氏殺菌[4]，即采用120～125 ℃，處理數(shù)秒，其溫度超過巴氏殺菌的溫度低于超高溫瞬時滅菌溫度。超巴氏殺菌是一種延長貨架期的技術(shù)，它最大可能的避免了加工和再包裝過程的污染[5]，其殺菌效果達(dá)到99%以上，可以有效控制乳中的微生物指標(biāo)[6]，并且經(jīng)過感官和儀器分析表明超巴氏殺菌牛奶具有明顯的煮熟和硫磺味道[7]；Lee等[8]研究不同熱處理條件對液態(tài)奶感官知覺的影響，表明低溫短時巴氏殺菌處理的牛奶比超巴氏殺菌牛奶具有更低的烹飪風(fēng)味；Bogahawaththa等[9]研究了脫脂乳的高壓處理對乳清蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并表明高溫長時巴氏殺菌處理對乳蛋白變性影響較??；Jiang等[10]研究熱處理對聚合乳清蛋白濃縮物和聚合乳清蛋白分離物的理化和乳化性能的影響，并通過測定乳清蛋白的黏度、乳化性及理化性質(zhì)比較兩種蛋白的乳化能力和穩(wěn)定性。目前，國內(nèi)外關(guān)于超巴氏殺菌處理對牛乳乳清蛋白的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性研究鮮有報道，本文以新鮮牛乳為原料，以巴氏殺菌為對照，研究超巴氏殺菌熱處理后乳清蛋白的結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性變化，為高品質(zhì)乳制品生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳（當(dāng)天產(chǎn)），哈爾濱本地奶站；考馬斯亮藍(lán)，甘油，十二烷基磺酸鈉（SDS, sodium dodecyl sulfate），-巰基乙醇，牛血清白蛋白（BSA, bovine albumin），美國通用公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

EPS601凝膠電泳儀，美國伯樂公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；PE Pyris 6差示掃描量熱儀，美國PerkinElmer公司；J-815圓二色譜儀，日本佳司科公司；F-4500熒光分光光度計，日本日立公司；Zetasizer Nano S90納米粒度測定儀，馬爾文儀器公司等。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫脂乳的制備及熱處理

將新鮮牛奶進(jìn)行離心脫脂，離心條件為：4 ℃、4 000 r/min離心30 min，然后棄去上層脂肪，得到脫脂乳。未經(jīng)過熱處理的脫脂乳作為對照組，將脫脂乳樣品放于水浴鍋中進(jìn)行低溫長時巴氏殺菌（65 ℃，30 min）和高溫短時巴氏殺菌（72 ℃，15 s），當(dāng)脫脂乳中心溫度達(dá)到試驗所需溫度時開始計時，此處所有溫度的測定均用溫度計進(jìn)行；采用高壓鍋加熱模擬超巴氏殺菌（121 ℃，5 s），將脫脂乳樣品置于高壓鍋中，設(shè)置高壓鍋為試驗溫度，開始加熱，當(dāng)高壓鍋顯示達(dá)到所需溫度和時間后，進(jìn)行斷電自然泄壓。將熱處理后的脫脂乳迅速于冷水中冷卻至室溫，然后置于4 ℃避光保存。

1.3.2 乳清蛋白的制備

采用等電點(diǎn)沉淀法[11]提取乳清蛋白，用1 mol/L HCl將脫脂乳的pH值調(diào)至4.6，然后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，保留上清液。所用乳清蛋白樣品最后都要用0.45m的注射器過濾器進(jìn)行過濾，濾液于-20 ℃冷凍保存。

1.3.3 SDS-PAGE凝膠電泳的測定

樣品SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的測定是根據(jù)Emmanuelle等[12-13]的方法并加以改動。對照樣品和處理樣品分別用去離子水將體積稀釋5倍，混合震蕩，與緩沖液按體積比4∶1進(jìn)行混合，煮沸5 min后，冷卻至室溫進(jìn)行上樣，采用120 V恒壓電泳1.5 h。電泳結(jié)束，凝膠用蒸餾水清洗3次，然后浸泡在考馬斯亮藍(lán)染色液中，進(jìn)行染色6 h。染色后的凝膠用脫色液浸泡脫色，脫色期間需要更換3次脫色液，至凝膠背景無色為止。

1.3.4 蛋白濃度測定

參考Toyama等的考馬斯亮藍(lán)方法[14]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別取0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、1.0 mL牛血清白蛋白（BSA, bovine albumin）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液于試管中，用去離子水補(bǔ)充到0.1 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染液，震蕩搖勻使其充分反應(yīng)，2 min后于可見光分光光度計595 nm波長下測量其吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其次用相同方法測定乳清蛋白樣品，將其吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，得出待測蛋白濃度。

1.3.5 紅外光譜分析

取100L乳清蛋白溶液，按照Qi等[15]的方法風(fēng)干處理，設(shè)置紅外光譜儀的分辨率為4 cm-1，在波數(shù)范圍為4 000 cm-1～400 cm-1進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)為32次，利用Peak-Fit 4.12對紅外光譜進(jìn)行分峰擬合計算。

1.3.6 熒光光譜分析

參考Gu等[16]的方法，將乳清蛋白樣品用去離子水稀釋10倍，設(shè)置激發(fā)波長為290 nm，在此波長下進(jìn)行發(fā)射波長的掃描，掃描光譜范圍為300～450 nm，掃描速度為60 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.7 粒徑測定

將乳清蛋白溶液用去離子水稀釋5倍，調(diào)整顆粒折射率為1.45，分散劑折射率為1.33，顆粒吸收率為0.887 2，采用Zetasizer Nano S90型納米粒度測定儀進(jìn)行粒徑分布的測定[17]。

1.3.8 DSC曲線的測定

將乳清蛋白溶液置于鋁盒中，密封后放于樣品箱內(nèi)，室溫條件下平衡8 h，空鋁盒為空白對照，加熱溫度從20～110 ℃，升溫速率為10 ℃/min，得到DSC曲線[18]。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 乳清蛋白純度及濃度的測定

乳清蛋白的純度測定結(jié)果見圖1。由圖1的乳清蛋白電泳圖中可以看出，酪蛋白條帶顏色非常淺，而-乳球蛋白（-Lg）和-乳白蛋白（-La）條帶清晰可見，這說明，該方法提取的乳清蛋白中酪蛋白含量較低，乳清蛋白純度較高。

圖1 等電點(diǎn)沉淀法提取乳清蛋白SDS-PAGE圖 Fig 1 SDS-PAGE patterns of whey protein under isoelectric precipitation

以考馬斯亮藍(lán)G250和梯度標(biāo)準(zhǔn)蛋白所形成的絡(luò)合物在595 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程=0.692 09+ 0.005 57，R=0.997 42，乳清蛋白濃度結(jié)果如表1所示，65 ℃，30 min和72 ℃，15 s處理的乳清蛋白樣品蛋白濃度下降不明顯，而121 ℃，5 s處理的樣品蛋白濃度降低約50%（從97%降至52%），是因為經(jīng)高溫?zé)崽幚砗蟛糠秩榍宓鞍仔纬奢^大的聚集體[19]無法透過0.45m過濾膜，導(dǎo)致蛋白含量減少。

表1 不同熱處理條件下蛋白濃度 Table1 Protein concentration under different heat treatment conditions

2.2 熱處理對乳清蛋白紅外光譜的影響

圖2為不同熱處理條件下乳清蛋白的紅外光譜結(jié)果。由圖可以看出，1 500～1 750 cm-1處的峰值發(fā)生了變化，這表明由于熱處理使得乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

注：除了121 ℃處理牛乳后提取的乳清蛋白，其他3組的紅外光譜圖重合為一個譜圖。

參考文獻(xiàn)[20-21]可知，二級結(jié)構(gòu)與各個子峰對應(yīng)關(guān)系為：-折疊結(jié)構(gòu)峰為1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1[20]，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)峰為1 637～1 645 cm-1，-螺旋結(jié)構(gòu)峰為1 646～1 664 cm-1，-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)峰為1 664～1 681 cm-1[21]。將不同熱處理條件下乳清蛋白的酰胺Ⅰ帶紅外光譜做二階導(dǎo)數(shù)，并利用Gauss峰型進(jìn)行擬合，通過峰型處理確定二級結(jié)構(gòu)各峰位，如圖 3所示。

根據(jù)峰位指認(rèn)確定各子峰與二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系后，計算其積分面積，從而得到各二級結(jié)構(gòu)的相對占比，如表2所示，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化通過表中4種結(jié)構(gòu)含量變化來表示。3種熱處理方式與對照組相比可以看出，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，均表現(xiàn)為-螺旋和-折疊含量減少，-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加。其中，65 ℃，30 min組-螺旋和-折疊含量變化最大，-折疊的含量變化相對較小，降低了3.5 %。Lee等[22]研究表明-折疊含量也減少，可能是由于-折疊結(jié)構(gòu)位于蛋白質(zhì)凝聚體內(nèi)部，由于較長時間的熱處理，使乳清蛋白中部分蛋白發(fā)生凝聚，在經(jīng)過0.45m的濾膜過濾后-折疊結(jié)構(gòu)隨著凝聚體過濾出去而含量減少。72 ℃，15 s組二級結(jié)構(gòu)含量變化不大，說明此條件對乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)無明顯影響。而121 ℃，5 s組-螺旋含量減少最多，表明此條件下蛋白質(zhì)發(fā)生了去折疊，這可能是由于過高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)氫鍵的斷裂[23]，超巴氏殺菌處理后乳清蛋白-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量的增加是因為在高溫處理時，-折疊結(jié)構(gòu)易轉(zhuǎn)變?yōu)?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，同時還會發(fā)生-轉(zhuǎn)角向無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變[24]，而結(jié)構(gòu)變得更為無序，所以超巴氏殺菌處理后乳清蛋白結(jié)構(gòu)會更加穩(wěn)定。

a. 對照組CKb. 65 ℃，30 min

c. 72 ℃，15 sd. 121 ℃，5 s

2.3 熱處理對乳清蛋白熒光光譜的影響

本研究條件激發(fā)波長設(shè)為290 nm，以色氨酸（Trp）為發(fā)射基團(tuán)的熒光光譜，如圖4所示，4個樣品的初始濃度基本相同，3種熱處理對乳清蛋白熒光光譜形狀并無顯著影響，但是經(jīng)過不同熱處理條件后，其色氨酸熒光強(qiáng)度都有所減小，而熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高先減小后增大，具體結(jié)果表示于表3。

圖4 不同條件熱處理下乳清蛋白熒光光譜圖

表2 不同熱處理條件下乳清蛋白的二級結(jié)構(gòu)占比

由表3可知，最大熒光強(qiáng)度值可以反映色氨酸殘基的微環(huán)境情況，乳清蛋白樣品的最大熒光強(qiáng)度值都大于330 nm，當(dāng)最大熒光強(qiáng)度>330 nm時，表示色氨酸殘基處于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境在中，當(dāng)最大熒光強(qiáng)度<330 nm時，表示色氨酸殘基處于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性環(huán)境中[25]，故本研究中乳清蛋白的色氨酸殘基都是位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中。與對照組相比，65 ℃，30 min和72 ℃，15 s熱處理的乳清蛋白樣品的最大熒光強(qiáng)度值無明顯變化，而經(jīng)過121 ℃，5 s熱處理的乳清蛋白樣品的最大熒光強(qiáng)度發(fā)生紅移，這說明溫度過高會使維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的疏水相互作用被破壞，從而引起蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化，蛋白的極性環(huán)境會增加，導(dǎo)致Trp的側(cè)鏈逐漸暴露于溶劑中。與對照樣品相比，經(jīng)過巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品其熒光強(qiáng)度都降低，而超巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品降低最為顯著，這可能是由于過高溫破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使發(fā)色團(tuán)暴露到溶劑中去，造成熒光強(qiáng)度降低[26]。

表3 不同熱處理條件下乳清蛋白熒光光譜的λmax及λ值

2.4 熱處理對乳清蛋白粒徑的影響

經(jīng)過熱處理的乳清蛋白會發(fā)生變性，這可能是因為乳清蛋白分子之間或者乳清蛋白與酪蛋白、乳糖之間發(fā)生相互作用而形成凝聚物；也可能是因為高溫處理使乳清蛋白三級結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生降解[27]，這都會導(dǎo)致蛋白的平均粒徑發(fā)生變化，粒徑是影響乳液穩(wěn)定性的一個重要因素[28]。圖5和圖6顯示出不同熱處理條件下乳清蛋白的粒徑分布和平均粒徑。

圖5 不同熱處理條件下乳清蛋白粒徑分布圖

圖6 不同熱處理條件下乳清蛋白平均粒徑

由圖5可知，80 %以上的乳清蛋白的粒徑主要分布在100～1 000 nm之間，平均粒徑為171.3 nm。未經(jīng)過熱處理的對照組乳清蛋白的粒徑分布只出現(xiàn)一個單峰，而65和72 ℃處理的乳清蛋白，表現(xiàn)出雙峰結(jié)構(gòu)，并且分布范圍變寬，這表明熱處理可能導(dǎo)致了可溶性-Lg凝聚體產(chǎn)生，所以出現(xiàn)了雙峰，隨著熱處理溫度的上升，凝聚物的體積微微增大，同時尺寸分布曲線變得更寬，Durand等[29]用色譜法測定乳清蛋白尺寸的結(jié)果的趨勢與本試驗的趨勢類似，這是由于經(jīng)過熱處理后形成的凝聚物的尺寸比天然蛋白質(zhì)的尺寸大。由圖6可知，72 ℃處理的乳清蛋白的平均粒徑（173.2 nm）比65 ℃處理后的平均粒徑（166.1 nm）大，這可能是由于加熱時間較長而增加了分子間相互作用的時間，從而形成的不溶性凝聚物經(jīng)過0.45m濾膜過濾而導(dǎo)致粒徑減小。而121 ℃處理后的乳清蛋白只出現(xiàn)一個峰，是由于加熱產(chǎn)生的可溶性凝聚體通過共價鍵與非共價鍵的相互作用重新形成了更大的不溶性凝聚體，無法通過0.45m濾膜過濾后，導(dǎo)致樣品中可溶性蛋白減少。

2.5 熱處理對乳清蛋白熱穩(wěn)定性的影響

圖7是不同熱處理條件下乳清蛋白的DSC分析圖譜，4個樣品表現(xiàn)出不同的變性溫度和變性焓，這可能是由于4種蛋白質(zhì)中存在的聚合體是以不同的比例的-Lg、-La、BSA等蛋白質(zhì)形成的，這些不同蛋白質(zhì)的共價鍵數(shù)以及非共價鍵數(shù)存在很大差異，使得蛋白結(jié)構(gòu)也存在巨大差異[30]所致。從圖中可以看出，與對照樣品相比，經(jīng)過巴氏殺菌熱處理的樣品乳清蛋白初始變性溫度都有所下降，而超巴氏殺菌處理的樣品變性溫度升高，說明超巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品穩(wěn)定性提高，這可能是因為熱處理改變了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使4個樣品的分子結(jié)構(gòu)存在差異。

a. 對照組CKb. 65 ℃，30 min

c. 72 ℃，15 sd. 121 ℃，5 s

由表4可知，65 ℃，30 min和72 ℃，15 s處理的2個樣品，都表現(xiàn)為變性溫度下降，熱焓升高，這是生成的-Lg凝聚體對熱較不穩(wěn)定，雖然都呈現(xiàn)出相同的趨勢，但變化程度有所不同，這可能是由于溫度不同導(dǎo)致兩者的變性程度和方向均有所差異。121 ℃，5 s處理的樣品的變性溫度高于其他樣品，這說明該處理條件下，乳清蛋白的穩(wěn)定性最好，這可能是由于高溫處理使乳清蛋白充分變性，蛋白中無序結(jié)構(gòu)含量增多，這與紅外光譜測定的乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化相吻合。

表4 DSC圖譜峰的綜合分析

3 結(jié) 論

1）牛乳經(jīng)巴氏殺菌后蛋白濃度無明顯變化，超巴氏殺菌使得蛋白濃度下降約50%，加熱溫度超過70 ℃以后乳清蛋白變性顯著；

2）巴氏殺菌對乳清蛋白的二級與三級結(jié)構(gòu)無顯著影響；超巴氏殺菌處理后的乳清蛋白，其二級結(jié)構(gòu)中以-螺旋為主的有序蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橐詿o規(guī)則卷曲為主的無序蛋白結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)會變得更加穩(wěn)定；

3）超巴氏殺菌的高溫能夠破壞乳清蛋白的三級結(jié)構(gòu)以及蛋白分子的疏水相互作用，其最大熒光強(qiáng)度發(fā)生紅移，使蛋白質(zhì)微環(huán)境的極性增加；

4）超巴氏殺菌后的乳清蛋白熱穩(wěn)定性增加，其熱變性溫度最高為99.9 ℃，會延長乳的保質(zhì)期，但其二級三級結(jié)構(gòu)都發(fā)生顯著改變，其營養(yǎng)價值也會發(fā)生變化。

[1] 呂加平，張書文，劉鷺，等. 巴氏殺菌奶加工技術(shù)及質(zhì)量控制現(xiàn)狀[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016，34(1): 9－15.

[2] 顧佳升. 關(guān)于巴氏殺菌奶[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2005，3(3): 97－99.

[3] SMIT G. 現(xiàn)代乳品加工與質(zhì)量控制[M]. 任發(fā)政，韓北忠，羅永，等主譯. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2006.

[4] 顧佳升，龔林妹，夏靜. 我國液態(tài)奶產(chǎn)品的系統(tǒng)分類和命名[J]. 食品工業(yè)，2004(1)：23－24.

[5] 高嬋. 淺談乳制品的熱處理[J]. 農(nóng)民致富之友，2017(3)：72.

[6] 黃慶飛，戴永恒，徐雪華. 玻璃瓶裝巴氏殺菌奶微生物指標(biāo)的控制[J]. 廣西畜牧獸醫(yī)，2004(5)：207－209.

[7] Jo Y, Benoist D M, Barbano D M, et al. Flavor and flavor chemistry differences among milks processed by high-temperature, short-time pasteurization or ultra-pasteurization[J]. Journal of Dairy Science, 2018, 101(5): 3812－3828.

[8] Lee A P, Barbano D M, Drake M A. The influence of ultra-pasteurization by indirect heating versus direct steam injection on skim and 2% fat milks[J]. Journal of Dairy Science, 2017, 100(3): 1688－1701.

[9] Bogahawaththa D, Buckow R, Chandrapala J, et al. Comparison between thermal pasteurization and high pressure processing of bovine skim milk in relation to denaturation and immunogenicity of native milk proteins[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2018, 47: 301－308.

[10] Jiang S, Altaf hussain M, Cheng J, et al. Effect of heat treatment on physicochemical and emulsifying properties of polymerized whey protein concentrate and polymerized whey protein isolate[J]. LWT- Food Science and Technology, 2018, 98: 134－140.

[11] 陳靜廷，卜登攀，馬露，等. 不同等電點(diǎn)沉淀法和超速離心法提取牛奶乳清蛋白的雙向電泳分析[J]. 食品科學(xué)，2014，35(20)：180－184. Chen Jingting, Bu Dengpan, Ma Lu, et al. Analysis of whey protein extracted by different isoelectric precipitations and ultracentrifugation methods from cow milk[J]. Food Science, 2014, 35(20): 180－184. (in Chinese with English abstract)

[12] Emmanuelle R, Palatasa H, Owen M, et al. Behavior of protein in the presence of calcium during heating of whey proteinconcentrate solutions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(24): 13156－13164.

[13] 韓奕奕，黃菲菲，王建軍，等. 凝膠電泳法（SDS-PAGE）測定乳與乳制品中Lg的含量[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2009，2(2)：74－77.

[14] Toyama H, Nishibayashi E, Saeki M, et al. Factors required for the catalytic reaction of PqqC/D which produces pyrroloquinoline quinine[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 354(1): 290－295.

[15] Qi P X, Ren D, Xiao Y, et al. Effect of homogenization and pasteurization on the structure and stability of whey protein in milk[J]. Journal of Dairy Science, 2015, 98(5): 2884－2897.

[16] Gu C F, Lan X F, Yu Y S, et al. Fluorescence spectrum of milk solution[J]. Acta Photonica Sinica, 2012, 41(1): 107－111.

[17] 李子超，徐明芳，向明霞，等. 巴氏殺菌與超高溫滅菌牛乳酪蛋白結(jié)構(gòu)差異性的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，34(2)：192－196. Li Zichao, Xu Mingfang, Xiang Mingxia, et al. Research on the structural differences of the casein from milk by pasteurization and ultrahigh temperature sterilization[J]. Journal of South China Agricultural University, 2013, 34(2): 192－196. (in Chinese with English abstract)

[18] Frydenberg R P, Hammershoj M, Andersen U, et al. Protein denaturation of whey protein isolates (WPIs) induced by highintensity ultrasound during heat gelation[J]. Food Chemistry, 2016, 192: 415－423.

[19] Matsudomi N, Kanda Y, Yoshika Y, et al. Ability of casein to suppress the heat aggregation of ovotransferrin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52( 15) : 4882－4886.

[20] Meng G, Ma C Y. Characterization of globulin from(red bean)[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2002, 37(6): 687－695.

[21] Long G, Ji Y, Pan H, et al. Characterization of thermal denaturation structure and morphology of soy glycinin by FTIR and SEM[J]. International Journal of Food Properties, 2015, 18(4): 763－774.

[22] Lee H L, Choi C, Lee S J. Membrane-bound-synuclein has a high aggregation propensity and the ability to seed the aggregation of the cytosolic from[J]. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(1): 671－678.

[23] Plaza D, Duvetter T, Van D P, et al. Influence of environmental conditions on thermal stability of recombinant aspergillus aculeatus pectinmethylesterase[J]. Food Chemistry, 2008, 111(4): 912－920.

[24] 李楊，王中江，王瑞，等. 不同熱處理條件下大豆分離蛋白的紅外光譜分析[J]. 食品工業(yè)科技，2016，37(8)：104－109.

[25] Halder U C J, Chakraborty N, Das S, et, al. Tryptophan dynamics in the exploration of micro-conformational changes of refolded-lactoglobulin after thermal exposure: A steady state and time-resolved fluorescence approach[J]. Acta Endocrinologica, 2012, 109(2): 227－230.

[26] 王喜波，張澤宇，葛洪如，等. 超聲輔助制備抗凍融大豆分離蛋白工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2016, 32(14): 272－278. Wang Xibo, Zhang Zeyu, Ge Hongru, et al. Processing optimization for improving fstability of soybean protein isolate by ultrasonic assisted glycosylation[J]. Transactions of the Chinese Society of AEngineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(14): 272－278. (in Chinese with English abstract)

[27] 李飛，隋新，劉紅娟，等. 熱處理對乳蛋白質(zhì)的影響[J]. 北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015，29(1)：35－40.

[28] 王喜波，崔強(qiáng)，張安琪，等. 超聲處理改善不同比例大豆-乳清混合蛋白理化性質(zhì)[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2018, 34(22): 299－305. Wang Xibo, Cui Qiang, Zhang Anqi, et al. Ultrasonic treatment improving physical and chemical properties of soybean-whey mixed protein in different proportions[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(22): 299－305. (in Chinese with English abstract)

[29] Durand D, Nicolai T. Heat induced aggregation, gelation and phase separation of the globular protein-lactoglobulin[J]. Handbook of Food Science, Technology, and Engineering, 2006, 93(93): 1－18.

[30] 劉振艷，徐紅華. 熱致乳蛋白微米凝膠的特性[J]. 中國乳品工業(yè)，2012，40(11)：7－9.

Effect of pasteurization and ultra-pasteurization on structure and thermal stability of fresh milk whey protein

Wang Xibo, Zhang Anqi, Wang Yuying, Cui Qiang, Zhou Guowei, Wang Lin

(,,150030,)

Milk is rich in nutrition, and it is a good medium for microorganisms, therefore, heat treatment are commonly used to sterilize in the process of liquid milk processing. Although the heat treatment can kill microorganisms in milk, it is possible to change the nutritional value and functional properties of milk, so it is essential to study the effects of heat treatment on the structural and properties of milk proteins, especially on whey protein monomers and casein monomers. The heat treatment of milk is generally carried out by pasteurized, and the ultra-pasteurized milk is also very popular recently. At present, there are few reports on the effects of heat treatment on the structural properties of milk whey protein. In this paper, defatted milk obtained by centrifugation through fresh milk as raw material. Then, the skim milk is subjected to low temperature long-term and high-temperature pasteurization and ultra-pasteurization treatment, and the casein are extracted by isoelectric precipitation, and finally whey protein was detected by different detection methods and techniques. So the effects of pasteurization and ultra-pasteurization on the structure and thermal stability of whey protein were discussed. The results of the protein concentration and SDS-PAGE gel electrophoresis showed that the whey protein content extracted by the isoelectric point method after heat treatment was high and the casein content was substantially absent. The results of infrared spectroscopy showed that pasteurization had little effect on the secondary structure of whey protein, while the content of-helix in whey protein was significantly reduced after ultra-pasteurization treatment, and the random curl content increased significantly, it indicated that there was no significant change in the secondary structure of whey protein after pasteurization treatment, and the development of disordered structure changed from ordered structure to disordered structure after superpasteurization treatment, thereby improving the thermal stability of whey protein. Fluorescence analysis showed the whey protein sample heat-treated at 121 ℃ for 5 s was red-shifted, indicating that super-pasteurization greatly changed the secondary and tertiary structure of whey protein, it is shown that too high temperature will destroy the tertiary structure of whey protein and increase the polarity of the protein microenvironment. DSC analysis showed thermal denaturation of whey protein sample treated at 121 ℃ for 5 s, the peak temperature was 99.9 ℃, which was higher than that of the pasteurized whey protein sample, indicating that the stability of the whey protein sample after the ultra-pasteurization treatment was significantly improved. This may be due to the ultra-high temperature treatment to fully denature the whey protein and increase the disordered structure in the protein, which also indicates that the whey protein aggregate formed by ultra-high temperature was heat stable and the degree of denaturation was irreversible. The production and demand of dairy products in China are very large and the consumer groups are extensive. Therefore, it is very important to carry out research on the related technology of dairy processing to ensure the quality and safety of dairy products and promote the healthy and rapid development of China’s dairy industry.

heat treatment; structural analysis; thermodynamic properties; pasteurization; ultra-pasteurization; whey protein

2018-10-22

2019-03-11

乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室開放課題（KLDS-18-004）

王喜波，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。Email：wangxibo@neau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.06.037

TS252.4

A

1002-6819(2019)-06-0307-06

王喜波，張安琪，王玉瑩，崔 強(qiáng)，周國衛(wèi)，王 琳. 巴氏殺菌和超巴氏殺菌對牛乳清蛋白結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2019，35(6)：307－313. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.06.037 http://www.tcsae.org

Wang Xibo, Zhang Anqi, Wang Yuying, Cui Qiang, Zhou Guowei, Wang Lin. Effect of pasteurization and ultra-pasteurization on structure and thermal stability of fresh milk whey protein[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(6): 307－313. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002- 6819.2019.06.037 http://www.tcsae.org