小鼠多亞型熱休克蛋白/肽疫苗聯(lián)合PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究*

李浩江 王振勇 沈師 高超 張彬 王澤昊 眭翔 崔雪梅 袁玫 劉舒云 郭全義王桂琴

肉瘤是來(lái)源于間葉組織的惡性腫瘤，于長(zhǎng)骨兩端多見，尤以股骨下端、脛骨上端及肱骨上端最多見。目前肉瘤的治療以外科手術(shù)切除為主，放化療配合為輔。但是手術(shù)和放化療具有嚴(yán)重不良反應(yīng)，一旦肺部轉(zhuǎn)移，治療效果更差?？鼓[瘤免疫研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)影響著腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)。腫瘤疫苗治療腫瘤的免疫療法是利用腫瘤細(xì)胞表達(dá)特異性蛋白而被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，消除腫瘤的治療方法［1］。即通過(guò)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng)［2］。

熱休克蛋白是高度保守的蛋白質(zhì)，存在于所有生命體的細(xì)胞中。根據(jù)基因序列的同源性、蛋白分子的結(jié)構(gòu)以及分子大小，熱休克蛋白分屬不同的家族［3］。熱休克蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）和細(xì)胞外基質(zhì)中［4-5］。腫瘤與正常組織相比，HSPs的表達(dá)升高，其中HSP70、HSP90和HSP27已被證明在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高并且抑制腫瘤細(xì)胞死亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，參與化療耐藥［6-7］。從細(xì)胞中釋放的HSPs（其中HSP70和gp96）也表現(xiàn)出了激活特異性免疫反應(yīng)的免疫原特性［8］，可以誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)識(shí)別腫瘤細(xì)胞。但是HSPs本身并不具有抗原性，而僅是作為抗原肽的載體，表明熱休克蛋白攜帶的相關(guān)小肽是負(fù)責(zé)腫瘤排斥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)［8］，其誘導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)依賴于宿主的APC和T淋巴細(xì)胞的存在。

新近的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在腫瘤的發(fā)生中，B7H1（PD-L1）抑制了機(jī)體特異性免疫的抗腫瘤作用。作為B7家族的共刺激分子在對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)中具有重要的影響［9］。在許多腫瘤組織中，B7H1表達(dá)隨抗腫瘤細(xì)胞因子的產(chǎn)生而上調(diào)。腫瘤相關(guān)的B7H1被認(rèn)為通過(guò)與免疫細(xì)胞表面PD-1受體相互作用而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸［10-12］。在mHSP/P免疫刺激作用的基礎(chǔ)上，加入PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑，對(duì)抗腫瘤的同時(shí)可抑制機(jī)體免疫的負(fù)調(diào)控作用，為臨床術(shù)后開發(fā)新的輔助治療策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和細(xì)胞系 斯貝福公司（北京）購(gòu)得6～8周齡18～22g的雌性C57小鼠［SCXK（京）2016-0002］，飼養(yǎng)于中國(guó)人民解放軍302醫(yī)院。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。MCA207肉瘤細(xì)胞株來(lái)自美國(guó)斯坦福大學(xué)宗康拉教授贈(zèng)予。L929細(xì)胞為中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所提供。

1.1.2 抗體及器材 HSP70/HSP90/Gp94/PD-L1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。PD-L1抑制劑購(gòu)自德國(guó)默克公司。DMEM 1×培養(yǎng)基，PBS 1×購(gòu)自美國(guó)康寧公司，胎牛血清購(gòu)自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所。蛋白質(zhì)層析柱（離子層析柱、高分辨率分子層析柱、親和免疫層析柱）和WB電泳以及轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自于美國(guó)博士德公司。HSP70、HSP90、HSP96、HSP110 Elisa試劑盒購(gòu)自于CUSABIO公司，IFN-γ和TNF-α Elisa試劑盒購(gòu)自中國(guó)聯(lián)科公司。使用的實(shí)驗(yàn)儀器共聚焦顯微鏡，WB曝光影相機(jī)，蛋白層析儀來(lái)自于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化研究中心。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)、Elisa實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤中各亞型熱休克蛋白的表達(dá) MCA207細(xì)胞復(fù)蘇后，以5×105μ/mL細(xì)胞濃度注入每只小鼠右后肢皮下，在腫瘤生長(zhǎng)14天時(shí)處死，取出腫瘤組織經(jīng)多聚甲醛液體固定12～24 h后切冰凍切片。PBS清洗切片后加3%雙氧水去除過(guò)氧化物酶，2%羊血清和0.5%Triton封閉切片1～2 h，加一抗（抗HSP70、抗HSP90、抗Grp94）孵育過(guò)夜。次日滴加Maxvision試劑，室溫下孵育10 min，后滴加DAB顯色液反應(yīng)3 min。最后自來(lái)水沖并洗蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。取腫瘤組織10～20 g，然后加40 mL細(xì)胞裂解液（RIPA、COCKTAIL、PMSF按100：2：1）裂解，4℃離心1 h后取上清。上清經(jīng)濾網(wǎng)和濾器（0.2μm）過(guò)濾后Elisa試劑盒檢測(cè)HSP70/HSP90/Grp94含量。測(cè)試遵循試劑盒說(shuō)明書完成。

1.2.2 mHSP/P和Grp94/P的制備、鑒定及細(xì)胞毒性測(cè)定 體外培養(yǎng)肉瘤細(xì)胞株MCA20，并經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞學(xué)活性測(cè)定后注入動(dòng)物體內(nèi)，培養(yǎng)至組織后取出（具體操作同前）。液氮中研磨并經(jīng)裂解液處理，在此基礎(chǔ)上濾網(wǎng)過(guò)濾組織顆粒制備成蛋白懸液。Grp94/P制備過(guò)程：首先對(duì)制備的蛋白懸液通過(guò)陰離子層析柱（緩沖液A：Tris 20 mmol/L；B：Tris 20 mmol/L，NaCl 1 mol/L pH=8.5）分離蛋白，收集有明顯蛋白峰出現(xiàn)的截?cái)唷Ｓ糜H和層析柱（緩沖液A：20 mmol/L Tris，pH=7.5；B：20 mmol/L檸檬酸，pH=3.0）分離出Grp94/P。mHSP/P制備過(guò)程：同前，首先使蛋白懸液通過(guò)陰離子層析柱，再用分子層析柱（緩沖液Tris 20 mmol/L，pH=8.5）對(duì)經(jīng)離子層析柱純化的蛋白做二次純化，分別收集不同截?cái)嗟南疵摰鞍走M(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白性質(zhì)，含有HSP70、HSP90、Grp94截?cái)嗟臉悠坊旌现苽鋗HSP/P。對(duì)制備的mHSP/P和Grp94/P的生物毒性進(jìn)行檢測(cè)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)mHSP/P（10、20、30μg/mL）和Grp94P（100、200、300 ng/mL）細(xì)胞毒性，具體操作根據(jù)試劑盒提示完成。

1.2.3 mHSP/P和Grp94/P抗腫瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 評(píng)價(jià)mHSP/P和Grp94/P疫苗的抗腫瘤活性，小鼠隨機(jī)分為3組（每組10只小鼠）：生理鹽水對(duì)照，Grp94/P，mHSP/P。接種腫瘤細(xì)胞后一天，1組注射生理鹽水（0.3 mL），2組接種Grp94/P（300 ng/只），3組接種mHSP/P（30μg/只）。通過(guò)腫瘤生長(zhǎng)曲線和小鼠生存曲線聯(lián)合評(píng)價(jià)治療作用。用卡尺每3天一次測(cè)量腫瘤橫徑（A）和長(zhǎng)徑（B），體積（V）由公式V＝（A2B/2）計(jì)算。有腫瘤發(fā)生，在治療后腫瘤未生長(zhǎng)或腫瘤消失被認(rèn)為治療有效。Elisa試劑盒測(cè)定3組小鼠腫瘤組織中的IFN-γ和TNF-α的變化。

1.2.4 MCA207上PD-L1的表達(dá) MCA207腫瘤細(xì)胞加入IFN-γ干預(yù)。對(duì)刺激前后免疫熒光染色測(cè)定PD-L1的改變，WB實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度IFN-γ（0、10、20、30μg/mL）干預(yù)下PD-L1表達(dá)的變化。

1.2.5 mHSP/P聯(lián)合PD-L1抑制劑治療中CD4+，CD8+T淋巴細(xì)胞的測(cè)定 小鼠隨機(jī)同前分為3組：生理鹽水對(duì)照組，mHSP/P組，mHSP/P+PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑組。在接種腫瘤細(xì)胞后一天，1組注射生理鹽水（0.3 mL），2組接種制備mHSP/P（30μg/只），3組接種制備的mHSP/P（30μg/只）與PD-L1抑制劑（60μg/只）。4周時(shí)處死小鼠，冰凍切片免疫熒光染色觀察CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次及以上的重復(fù)檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)分析涉及使用GraphPad Prism 5。采用方差分析比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血液中的IFN-γ、TNF-α分泌水平，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠生存曲線由GraphPad Prism 5繪制并進(jìn)行生存分析。

2 結(jié)果

2.1 MCA207肉瘤細(xì)胞中HSP70、HSP90、Grp94的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色顯示肉瘤組織中表達(dá)3種熱休克蛋白HSP70、HSP90、Grp94（圖1）。Elisa定量測(cè)定3種蛋白，發(fā)現(xiàn)在肉瘤組織中Grp94的含量與前兩者相比較高（表1，P＜0.05）。

圖1 肉瘤中熱休克蛋白HSP70、HSP90、Grp94的免疫組織化學(xué)染色（IHC×200）

表1 Elisa實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤組織中HSP含量的 （ng/mL）

2.2 制備mHSP/P和Grp94/P

蛋白懸液經(jīng)過(guò)離子層析后又分別經(jīng)過(guò)分子層析柱和親和層析，組織液通過(guò)陰離子層析柱后（圖2A）蛋白主要出現(xiàn)在A17～A30，通過(guò)WB鑒定三種蛋白亞型主要出現(xiàn)在A19～A20截?cái)?。分子層析柱在離子層析柱的結(jié)果下對(duì)A19～A20截?cái)嗟鞍准兓肿訉游鲋械鞍字饕霈F(xiàn)在A20～A30（圖2B），通過(guò)WB鑒定HSP70主要出現(xiàn)在A25～A26截?cái)啵琀SP90主要出現(xiàn)在A25～A27截?cái)?，Grp94主要出現(xiàn)在A23～A24截?cái)啵謩e收集各截?cái)嘟M合成為mHSP/P。在離子層析的結(jié)果下通過(guò)親和層析柱，在A4截?cái)喑晒Λ@得了Grp94/P（圖2C），在檢測(cè)mHSP/P和Grp94/P的細(xì)胞毒性中，實(shí)驗(yàn)證實(shí)mHSP/P未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性（圖3A）。流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明mHSP/P和Grp94/P均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性（圖3B，均P＞0.05）。

2.3 mHSP/P比Grp94/P刺激機(jī)體產(chǎn)生更多抗腫瘤細(xì)胞因子

對(duì)荷瘤小鼠經(jīng)mHSP/P和Grp96/P刺激14～16天時(shí)測(cè)定小鼠血清中IFN-γ和TNF-α含量。Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TNF-α在對(duì)照組中為130.5±5.6，Grp94/P組中為186.29±5.6，mHSP/P組中為470.28±28.5，IFN-γ在對(duì)照組中為26.75±5.25，Grp94/P組中為44.32±4.9，mHSP/P組中為63.25±5.0（表2）。mHSP/P與Grp94/P組相比能產(chǎn)生更多的IFN-γ和TNF-α（圖4，P＜0.05）。

2.4 mHSP/P比Grp94/P更能延緩腫瘤的生長(zhǎng)及延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中（圖5A），mHSP/P組與Grp94/P組相比更有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)（圖5B）。mHSP/P組與Grp94/P組相比，明顯較對(duì)照組延長(zhǎng)了小鼠的生存期（圖5C），對(duì)照組和Grp94/P以及mHSP/P平均存活時(shí)間分別為（36±6）、（52.5±5.5）、（66±5.1）天。通過(guò)mHSP/P治療有效地延緩了腫瘤生長(zhǎng)。

圖2 mHSP/P和Grp94/P的制備和鑒定

圖3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定mHSP/P肉瘤疫苗和Grp94/P肉瘤疫苗的細(xì)胞毒性

表2 三組不同的治療方案中IFN-γ和TNF-α表達(dá)的差異 （pg/mL）

2.5 細(xì)胞因子IFN-γ刺激MCA207肉瘤細(xì)胞上PDL1的表達(dá)升高

本研究表明，MCA207在沒有IFN-γ刺激時(shí)，細(xì)胞表面PD-L1處于低表達(dá)狀態(tài)，在IFN-γ刺激后，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)升高（圖6A）。WB實(shí)驗(yàn)也顯示MCA207肉瘤細(xì)胞在不同濃度的IFN-γ刺激下PD-L1出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)（圖6B）

圖4 mHSP/P肉瘤疫苗和純Grp94/P肉瘤疫苗刺激抗腫瘤細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生，*：P＜0.05

圖5 mHSP/P肉瘤疫苗和純化的Grp94/P肉瘤疫苗的抗腫瘤作用

圖6 PD-L1的表達(dá)變化

2.6 mHSP/P聯(lián)合PD-L1抑制劑促進(jìn)淋巴細(xì)胞的殺傷作用

本研究結(jié)果顯示CD8+T細(xì)胞在mHSP/P+PD-L1組中比mHSP/P組和對(duì)照組增加。同時(shí)CD4+T細(xì)胞也有增多的趨勢(shì)。進(jìn)一步對(duì)腫瘤的中心和邊界細(xì)胞染色鑒定發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組無(wú)論在邊界還是在腫瘤內(nèi)部，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目均要高于對(duì)照組（圖7）。

圖7 免疫熒光染色標(biāo)記腫瘤組織中CD8和CD4細(xì)胞的侵襲（CD8用綠色熒光標(biāo)記，CD4用紅色熒光標(biāo)記）

3 討論

以往實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)刺激免疫反應(yīng)抗腫瘤作用的熱休克蛋白包括HSP110、HSP90、HSP70和HSP60。大分子的HSP（如HSP110、Grp94）較小分子結(jié)合抗原肽的數(shù)量更多，具有更有效的免疫刺激抗腫瘤作用。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Grp94作為疫苗較其他常見亞型具有含量豐富、分子量較常見亞型大、可以結(jié)合抗原肽數(shù)量多的優(yōu)勢(shì)。Grp94是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的肽結(jié)合受體，能夠促進(jìn)MHC-Ⅰ類分子與肽分子的結(jié)合。本研究成功制備了mHSP/P和Grp94/P，并且發(fā)現(xiàn)mHSP/P比Grp94/P擁有更強(qiáng)的抗腫瘤特性［13］。若以消除術(shù)后微小殘留病為目標(biāo)，這種方法作為輔助治療可起到防止腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的作用［14-16］。

既往研究中發(fā)現(xiàn)HSP疫苗刺激抗腫瘤細(xì)胞因子（IL-1β、IL-12、TNF-α和IL-6）的釋放，使得研究人員對(duì)于熱休克蛋白疫苗介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生了興趣［17］。本研究發(fā)現(xiàn)mHSP/P組和Grp94/P組中IFN-γ、TNF-α的產(chǎn)生均高于對(duì)照組，且mHSP/P組高于Grp94/P組。但是，IFN-γ的出現(xiàn)在對(duì)抗腫瘤的同時(shí)也促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)增高。PD-L1的激活可促使免疫細(xì)胞失活以及腫瘤免疫逃逸的發(fā)生。

以往的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，疫苗誘導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫依賴于宿主體內(nèi)抗原提呈細(xì)胞（APC）和T淋巴細(xì)胞的存在。Grp94/P被證明通過(guò)APC激活或直接相互作用能夠調(diào)節(jié)自然殺傷（NK）細(xì)胞活性，同時(shí)激活中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。隨著研究的逐漸深入，熱休克蛋白的聯(lián)合治療可能為臨床抗腫瘤提供最有希望的途徑。本課題組以往實(shí)驗(yàn)表明，熱休克蛋白疫苗聯(lián)合的治療方式要優(yōu)于單獨(dú)腫瘤疫苗治療［18］。隨著FDA批準(zhǔn)了CTLA-4、IPILIMUMAB作為第一種單克隆抗體拮抗劑治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤［19］的使用，熱休克蛋白聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗腫瘤效果更加突出。本研究在肉瘤治療中利用mHSP/P聯(lián)合PDL1抑制劑，發(fā)現(xiàn)疫苗激活了免疫細(xì)胞。后續(xù)將對(duì)負(fù)調(diào)控細(xì)胞，如Treg等做進(jìn)一步的抗腫瘤作用研究，這對(duì)探索PD-L1抑制劑在其中的聯(lián)合作用至關(guān)重要。

臨床試驗(yàn)中可以用自體腫瘤制備腫瘤疫苗，因材料的來(lái)源于自體腫瘤組織，精減了倫理審批步驟［20］。本課題組前期研究提出混合化的熱休克蛋白由于包含不同亞型和攜帶更多的抗原肽而較純化疫苗具有更強(qiáng)的免疫刺激抗腫瘤作用［18］。本研究存在的問題是純化的Grp94/P疫苗在制備過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)大量的損失而很難準(zhǔn)確估計(jì)最后的得量。

熱休克蛋白腫瘤疫苗作為腫瘤免疫療法，旨在提高腫瘤術(shù)后患者的免疫反應(yīng)。在肉瘤的治療中，通過(guò)外科切除的方式，提取腫瘤組織中特有的mHSP/P，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑，可以有效地抑制腫瘤的發(fā)展，在刺激免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤的同時(shí)降低了自身存在的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。