苗藥九仙羅漢接骨湯促進(jìn)SD大鼠脛骨骨折愈合中TGF-β1動(dòng)態(tài)表達(dá)

羅清龍 唐良華 熊屹 劉玉召

(1.四川省德昌縣人民醫(yī)院骨科，四川 德昌 615500；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨二科，貴州 貴陽 550002；河南省開封市人民醫(yī)院骨科，河南 開封 475000)

骨折是指骨的力學(xué)完整性、連續(xù)性的丟失，繼而患者自感傷處疼痛，體查發(fā)現(xiàn)骨折處出現(xiàn)腫脹、功能障礙及局部骨擦音、異?；顒?dòng)等表現(xiàn)的一類疾病，常因外傷而引起，是最為常見的外科疾病之一。苗醫(yī)藥加速骨折愈合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、病例研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)組運(yùn)用現(xiàn)代基因及蛋白檢測的技術(shù)，檢測苗藥九仙羅漢接骨湯對SD大鼠脛骨骨折后TGF-β1細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)表達(dá)，以探究其加速骨折愈合的機(jī)理。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡健康SD大鼠120只，SPF級(jí)，雌雄各半，體重(220±20) g，由貴陽中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物所購買。許可編號(hào)：SCXK-(軍)2012-0011。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 九仙羅漢接骨湯煎劑由仙桃草20 g、九節(jié)茶15 g、地羅漢3 g組成。九仙羅漢接骨湯的成人(70 kg)每日劑量為生藥0.54 g/kg，按人/鼠體表面積比率換算等效計(jì)量法計(jì)算后，每只每天0.68 g/mL，稀釋至0.17 g/mL。按傳統(tǒng)方法煎煮后無菌封瓶，4 ℃冷藏柜儲(chǔ)存?zhèn)溆?。生理鹽水(均由貴陽中醫(yī)二附院提供)。

1.1.3主要試劑和儀器 SABC免疫組化試劑盒(Biomics公司)；DAB顯色試劑盒及一抗、二抗、PBS緩沖液(Boisynthesis公司)；EDTA脫鈣液(pH 7.2)、4%多聚甲醛、二甲苯、Goldview Ⅰ(美國Solarbio公司)；TriZol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒、5x RNA Loading Buffer(TaKaRa Bio公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；瓊脂糖凝膠電泳儀、瓊脂糖凝膠電泳槽(BIORAD公司)；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(德國Thermo Scientific公司)、顯微圖像分析儀(德國opten公司)。

1.2方法

1.2.1骨折模型的建立(改良鉆孔法) 大鼠采用腹內(nèi)注射法麻醉(7%水合氯醛，0.5 mL/100 g)，麻醉滿意后予6%的硫化鈉左下肢脫毛備皮，清潔紗布擦拭，右側(cè)臥位放于造模臺(tái)上，自制固定模具使左小腿水平放置。碘伏棉球由左足到左大腿上段消毒3遍。無菌布巾覆蓋展露造模區(qū)四周，鉗定穩(wěn)固。于脛骨結(jié)節(jié)下2 mm沿脛骨脊切長約1.5 cm縱行切口，分撥鼠外皮，繼續(xù)沿脛骨脊外側(cè)緣0.5 mm縱軸方向切開淺、深筋膜層，分撥開脛骨前肌群，展露脛骨外骨面。充分顯露術(shù)野后，小功率鉆在鼠膝關(guān)節(jié)脛骨結(jié)節(jié)下2 m處由脛骨外骨面向髓腔造孔道1，鉆頭直徑為0.3 mm，可鉆達(dá)髓腔，但不破壞內(nèi)側(cè)骨外皮質(zhì)，原孔道1處換1 mm鉆頭擴(kuò)大孔道，在第一孔下沿脛骨縱軸方向，孔間距2 mm，依照前法造孔道2及孔道3。生理鹽水沖洗后，分層縫合切口處組織，適量紅霉素軟膏外敷傷口及周緣，麻醉清醒后分籠飼養(yǎng)，此后持續(xù)3 d給予8萬單位青霉素肌內(nèi)注射[1]。

1.2.2分組及標(biāo)本取材 所有造模成功大鼠隨機(jī)均分成接骨湯組、生理鹽水組。接骨湯組麻醉復(fù)蘇后灌予九仙羅漢接骨湯，2 mL/次，Bid，生理鹽水組灌予等量生理鹽水。常規(guī)分籠飼養(yǎng)。術(shù)后1、3、7、14、21、28 d分批拉頸處死，每組各10只，以造模處為中心取10 mm骨段。

1.2.3免疫組化技術(shù)檢測骨痂組織中TGF-β1表達(dá) 截取5 mm骨段，4%多聚甲醛淹沒標(biāo)本，4 ℃冰箱下固定24 h，予PBS液清洗×3次，20 min/次。移至EDTA中脫鈣，量約10mL ，更替EDTA液1 W/次，持續(xù)30 d。不銹鋼針插入后未感受阻力，此情況提示脫鈣達(dá)標(biāo)。2%NaOH浸泡，時(shí)間10 min，雙蒸水洗，時(shí)間10 min。依次經(jīng)乙醇脫水六次，放入無水乙醇與二甲苯比例1∶1液體中20 min，轉(zhuǎn)移至純二甲苯20 min。侵蠟30 min。包埋后運(yùn)用切片機(jī)以骨折端中央為中心縱行切開制成5 μm厚的蠟片，40 ℃水中展片至無皺褶，放置于60 ℃烘箱40 min，烘干切片。依次經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、染色、顯色劑顯色、復(fù)染、分化、藍(lán)化、脫水后中性樹脂封片，光鏡觀察。結(jié)果判定：蛋白水平表達(dá)與大鼠脛骨骨痂組織中出現(xiàn)褐黃色顆粒數(shù)及顏色深度呈正相關(guān)性。未顯褐黃色者為陰性。10×40倍光鏡下視檢采圖，所得骨組織片再在10×10倍光鏡下隨機(jī)抽取3個(gè)視野作陽性表達(dá)計(jì)數(shù)，各標(biāo)本TGF-β1表達(dá)的計(jì)量指標(biāo)以3個(gè)視野計(jì)數(shù)均值為準(zhǔn)。

1.2.4q-PCR檢測骨痂細(xì)胞中TGFβ1mRNA表達(dá)量 研磨缽在180℃環(huán)境烤干1.5～2h，將從-80℃冰箱中取出已備好的骨痂組織用骨鉗夾碎后放入研磨缽中，棒研磨標(biāo)本加入覆蓋骨痂組織的液氮后使用研磨成細(xì)粉，提取骨痂組織中的總RNA。所選基因引物序列由上海凱信生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。TGF-β1擴(kuò)增片斷長度為111 bps，其上游引物序列為：5’TCAATACGTCAGA-CATTCGG3’，下游引物序列：5’TACCAAGGTAACGCCAGGA 3’。同時(shí)以擴(kuò)增片段長度155 bp 的actin 作為內(nèi)參照，actin上游引物序列：5’-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3’，下游引物序：5’-AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3’。采用瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA完整性。NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行總RNA濃度及OD260/280檢測，測定總RNA質(zhì)量是否達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。在ABI 7500 PCR器上進(jìn)行操作，反應(yīng)設(shè)置為：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，1 min。重復(fù)第2步，共40個(gè)循環(huán)。采用染料法(SYBR Green I)進(jìn)行TGF-β1mRNA相對定量分析，用2-△△ct法分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分析 骨折模型的制作過程中，4只SD大鼠因麻醉不當(dāng)而死亡，均予以補(bǔ)充。大鼠左脛骨造模術(shù)口均愈合良好，無一例感染。拉頸處死前所有大鼠均健活，且生長良好，飲食、二便、呼吸頻率、精神狀態(tài)和活動(dòng)均正常，口、鼻、耳、眼均無異常分泌物，說明苗藥九仙羅漢接骨湯口服具有一定的安全性。

2.2免疫組化檢測結(jié)果分析 TGF-β1蛋白表達(dá)水平與大鼠脛骨骨痂組織中出現(xiàn)褐黃色顆粒數(shù)及顏色深度呈正相關(guān)性。與生理鹽水組相比，接骨湯組中TGF-β1的MOD值在骨重建14～28 d時(shí)差異顯著(P<0.01)。該結(jié)果提示在苗藥干預(yù)后14～28 d接骨湯組中的TGF-β1的平均光密度值的升高程度明顯高于生理鹽水組。接骨湯組骨折模型所取標(biāo)本中骨祖細(xì)胞數(shù)量、成軟骨細(xì)胞數(shù)量、骨小梁出現(xiàn)的時(shí)相及重建程度均優(yōu)于生理鹽水組。見表1、圖1。

表1 不同時(shí)相中TFG-β1平均光密度值

注：與生理鹽水組比較▲P<0.01。

圖1 兩組不同時(shí)相TGF-β1的免疫組化檢測( ×400)

2.3q-PCR方法檢測結(jié)果 理想的RNA純度A260/A280應(yīng)在1.9～2.1范圍之間。經(jīng)檢測，各組總RNA的純度及濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。骨痂組織總RNA提取結(jié)果可明顯見28S、18S條形光帶的出現(xiàn)，且28S條形光帶明亮度約為18S條形光帶的2倍，條帶周圍未見拖尾現(xiàn)象，說明接骨湯組和生理鹽水組中樣本提取的RNA具有良好的完整性，符合本實(shí)驗(yàn)要求，見圖2。

圖2 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.4不同時(shí)間中TGF-β1mRNA相對表達(dá)情況 接骨湯組在造模后第1～3天TGF-β1mRNA表達(dá)量與生理鹽水組相當(dāng)(P>0.05)；在7 d時(shí)接骨湯組表達(dá)量是生理鹽水組的1.34倍，相較有差異(P<0.05)；在14 d時(shí)接骨湯組表達(dá)量是生理鹽水組的1.45倍，在21 d時(shí)接骨湯組表達(dá)量是生理鹽水組的1.85倍，在28 d時(shí)接骨湯組表達(dá)量是生理鹽水組的2.05倍，14～28 d時(shí)相同時(shí)相比較均有顯著差異(P<0.01)。見表2。

表2 不同時(shí)間中 TGF-β1mRNA相對表達(dá)

注：與生理鹽水組比較，△P<0.05，▲P<0.01。

3 討 論

苗族醫(yī)者認(rèn)為氣與血是人體的重要要素，其與人體健康密切相關(guān)，因此“氣常阻，血常瘀”是人體發(fā)病的重要原因之一。本課題組從中醫(yī)“骨折三期分治”和苗醫(yī)“通氣散血法”、“毒亂致病論”相結(jié)合下的理論指導(dǎo)下挖掘出民間經(jīng)驗(yàn)方苗藥九仙羅漢接骨湯，其具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、接骨續(xù)筋之功效。方中藥物由仙桃草、九節(jié)茶、地羅漢組成。先現(xiàn)代藥理學(xué)來看，綠原酸做為仙桃草主要成分之一，其能夠明顯的加快成骨折后骨細(xì)胞增殖分化，從而加速骨折愈合[2]。方芳等[3]對仙桃草促進(jìn)骨折愈合機(jī)制進(jìn)行探討，通過兔骨缺損造模仙桃草干預(yù)性治療后檢測VEGF細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)單味苗藥仙桃草可在骨重建早期提高VEGF的表達(dá)，獲得加速骨重建的效應(yīng)。仙桃草內(nèi)服能促進(jìn)骨不連模型兔骨折端中BMP-2、VEGF表達(dá)從而使兔橈骨骨不連得到改善[4-5]。臨床研究[6]也表明仙桃草具有幫助骨折斷端重建、修復(fù)的效果。本實(shí)驗(yàn)組前期[7-9]，通過苗藥九仙羅漢接骨湯干預(yù)兔脛骨干骨折動(dòng)物模型，并以血Ca、血P、ALP、X線片評(píng)定骨痂生長、HE染色及VEGF免疫組化結(jié)果為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)苗藥九仙羅漢接骨湯使骨痂成型加快，進(jìn)而有減少骨折愈合時(shí)間的效果。

TGF-β家族都是由兩條相同肽鏈組成的多肽。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，相對于TGF-β2和TGF-β3只有在軟骨形成期才能表達(dá)，TGF-β1在骨重建啟動(dòng)后表達(dá)的時(shí)間最長，且在骨組織中含量較高。組織中的TGF-β1在骨折后重建過程中，具有加快成骨母細(xì)胞有絲分裂的的生物學(xué)功能，增加骨折部位成骨細(xì)胞、成骨基質(zhì)的募集，并且在整個(gè)骨重建的過程中TGF-β1都會(huì)周期性增長并參與整個(gè)骨折愈合的調(diào)節(jié)，只是在不同時(shí)期TGF-β1表達(dá)情況不同。本研究結(jié)果中，接骨湯組與生理鹽水組的TGF-β1蛋白及基因的表達(dá)均呈階梯性增長，再次驗(yàn)證了TGF-β1參與整個(gè)骨折愈合過程。TGF-β1是骨重建過程中軟骨內(nèi)成骨的標(biāo)志性因子之一[12]。相關(guān)研究[13]發(fā)現(xiàn)，通過桃紅四物湯調(diào)控外源性TGF-β1，作用于骨母細(xì)胞，從而對成骨細(xì)胞的數(shù)量及活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，加快骨重建。本研究結(jié)果中，1～7 d時(shí)，接骨湯組與生理鹽水組TGF-β1平均光密度值同一時(shí)段相當(dāng)。而在14～28 d時(shí)，接骨湯組14～28 d時(shí)間內(nèi)MOD值顯著高于生理鹽水組。接骨湯組在造模后第1～3 d TGF-β1mRNA表達(dá)量與生理鹽水組同一時(shí)段相當(dāng)；而在7～28 d時(shí)相內(nèi)，接骨湯組TGF-β1mRNA表達(dá)量分別是生理鹽水組的1.34倍、1.45倍、1.85倍、2.05倍。兩組TGF-β1基因及蛋白的表達(dá)量在骨折愈合過程中隨時(shí)相的增加而階梯性增長，但生理鹽水組表達(dá)明顯低于接骨湯組。免疫組織化學(xué)檢測中，接骨湯組骨折模型所取標(biāo)本中骨祖細(xì)胞數(shù)量、成軟骨細(xì)胞數(shù)量、骨小梁出現(xiàn)的時(shí)相及重建程度均好于生理鹽水組。

綜上，通過九仙羅漢接骨湯干預(yù)后增強(qiáng)TGF-β1表達(dá)從而有效的縮短了模型鼠骨重建的時(shí)間。不足之處在于，此次實(shí)驗(yàn)中只是根據(jù)不同時(shí)相進(jìn)行分組，未探究苗藥九仙羅漢接骨湯低、中、高濃度的最佳配比，得出最佳效果；其次，苗藥九仙羅漢接骨湯的毒副作用實(shí)驗(yàn)尚未完善，均擬在下一步實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探究。