非手術性牙周治療改善肥胖伴牙周炎大鼠腎功能異常和氧化應激狀態(tài)

曾嘉皓， 吉春蘭， 柴巧學， 鐘素蘭， 鄒川， 倪佳， 陳蕾

(1.南方醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院； 南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院， 廣東 廣州 510280；2.廣州中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院， 廣東 廣州 510405； 3.廣東省中醫(yī)院， 廣東 廣州 510120)

牙周炎是侵犯牙周支持組織的慢性炎癥性破壞性疾病，會使患牙松動甚至脫落，還與肥胖[1]、2型糖尿病[2-4]、心肌梗死[5]、高脂血癥[6]、腎病[7]等多種疾病密切相關.肥胖(obesity)已成為一個日漸突出的公共健康問題，它被定義為一種氧化應激(oxidative stress)狀態(tài)[8]，是多種系統(tǒng)性疾病進展的重要危險因素.現有證據表明，僅患有重度牙周炎并無其他系統(tǒng)性疾病的患者，其腎功能并不會發(fā)生改變[9]；動物研究[10]則發(fā)現，實驗性牙周炎會引起正常Wistar大鼠腎臟組織結構改變，增強腎臟的氧化應激狀態(tài)，但并不會引起腎功能變化.而在機體患有系統(tǒng)性疾病如2型糖尿病的情況下，牙周炎會影響腎功能的發(fā)生和發(fā)展[11].目前，肥胖狀態(tài)下牙周炎對腎功能和氧化應激狀態(tài)的影響鮮有報道，故本研究旨在探索牙周炎對肥胖大鼠腎功能及氧化應激狀態(tài)的作用.

非手術性牙周治療(non-surgical periodontal therapy)是控制牙周疾病的有效手段.研究發(fā)現，非手術性牙周治療能增加慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)患者腎小球濾過率[12]，顯著降低2型糖尿病患者的血清超敏C-反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hsCRP)水平[2]，改善肥胖伴實驗性牙周炎大鼠的胰島素抵抗[13]，對系統(tǒng)性疾病機體的腎功能和全身炎癥狀態(tài)有一定改善作用.本研究擬探討實驗性牙周炎及非手術牙周治療對肥胖大鼠腎功能和氧化應激狀態(tài)的影響.

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料

Sprague-Dawley(SD)大鼠(廣東省醫(yī)學動物實驗中心提供并飼養(yǎng)，生產許可證：SCXK(粵)2013-0002，質量合格證明編號：44007200013956)；高脂飼料(廣東省醫(yī)學動物實驗中心提供，能量比：蛋白質20%，碳水化合物20%，脂肪60%;總計約5.24 kcal/g).

水合氯醛，購自青島宇龍海藻公司；慕絲線，購自廣州威佳生物有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒,購自美國賽默飛世爾科技公司；8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)檢測試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；丙二醛(malondialdehyde,MDA)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；雙目顯微鏡及照相機(OLYMPUS, MP5.0).

1.2 實驗方法

(1)實驗動物及分組：從45只SPF級4周齡雄性SD大鼠中隨機選取10只作為健康對照組，普通飼料喂養(yǎng).35只喂食高脂飼料以建立肥胖大鼠模型，每周測量動物體質量，連續(xù)16周后，篩選體質量比健康對照組高15%的30只大鼠作為肥胖大鼠，并隨機分為肥胖對照組(n=10)和肥胖伴實驗性牙周炎大鼠(n=20)，后者在質量分數為7%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹膜內注射麻醉后，將雙側上頜第二磨牙用3-0慕絲線壓入齦溝內，頰側結扎4周以誘導實驗性牙周炎，每周麻醉后檢查結扎絲線是否牢固，如有松脫則重新結扎.結扎期間每周測量動物體質量.實驗初始(4周)及20周時，分別測量動物體長，并按公式計算Lee’s指數：

牙周結扎期間，共有4只肥胖-牙周炎大鼠死亡.結扎4周后，將16只肥胖伴實驗性牙周炎大鼠按體質量配對，進一步分為肥胖伴實驗性牙周炎組和牙周治療組(每組n=8).牙周治療組大鼠行局部牙周非手術治療：質量分數為7%的水合氯醛全麻下，去除結扎絲線，進行齦上、齦下潔治，用含體積分數1%的過氧化氫和碘甘油的小棉球清潔牙周碎屑.在此期間，肥胖伴實驗性牙周炎組大鼠繼續(xù)結扎.2周后，質量分數為10%的水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射，過量麻醉處死所有大鼠[13].動物建模及治療操作見圖1.

圖1 動物建模及治療操作

Fig.1 Establishment of animal model and non-surgical periodontal therapy

在整個實驗過程中，高脂飲食過程剔除了5只體質量未達標大鼠，肥胖伴實驗性牙周炎大建模過程中有4只大鼠死亡，健康對照組有2只大鼠因體質量過高而被剔除，肥胖對照組有2只大鼠死亡，故最后進入統(tǒng)計分析的SD大鼠共32只，健康對照組、肥胖對照組、肥胖伴實驗性牙周炎組和牙周治療組各8只.實驗分組及流程詳見圖2.

圖2 實驗分組及流程

(2)麻醉大鼠后進行腹主動脈取血，每只取血量約為10 mL，4 ℃靜置30 min后，3 500 r/min離心15 min,收集上清液血清.通過全自動生化分析儀檢測血清腎功能指標肌酐和尿素氮.

(3)收集雙側上頜第二磨牙及牙周、頜骨組織，質量分數為4%的多聚甲醛溶液固定48 h，將組織修整為大小約1.5 cm×0.5 cm 小塊，乙二胺四乙胺(ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA)脫鈣液(pH=7.4)脫鈣8周.石蠟包埋，制成5 μm病理切片.常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察組織結構.

(4)收集雙側腎臟，縱切，一半于質量分數為4%的多聚甲醛溶液中固定，制成石蠟切片，HE染色；另一半在液氮中快速冷凍，冰上研磨，3 500 r/min離心15 min，收集組織上清液，BCA法檢測上清液中蛋白濃度，分別檢測腎組織中MDA、SOD、GSH和8-OHdG的表達情況.

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠的體質量變化

高脂飼料喂養(yǎng)16周后，肥胖對照組大鼠體質量為(750.80±77.06)g，高出健康對照組15.2%[健康對照組體質量(651.08±49.36)g](P=0.015)；肥胖對照組Lee’s指數(387.09±11.08)顯著高于健康對照組(368.82±12.16)(P=0.005)[14].不同時間點的大鼠體質量及Lee’s指數見表1、表2.由表1可知，各組別的大鼠在整個實驗期間，隨著時間的推移，體質量總體呈上升趨勢(P<0.05)；相同周齡的不同組別大鼠組間比較，肥胖伴實驗性牙周炎組的體質量變化較肥胖對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，牙周治療組的體質量變化較肥胖伴實驗性牙周炎組亦無統(tǒng)計學差異(P>0.05).此結果表明，高脂飼料喂養(yǎng)16周后，肥胖模型建立成功，在整個實驗期間，實驗性牙周炎及非手術性牙周治療并未對大鼠體質量產生顯著影響.

2.2 非手術性牙周治療對肥胖伴實驗性牙周炎大鼠牙周組織的影響

HE染色顯示，健康對照組牙齦上皮緊密附著于釉牙骨質界，沒有附著喪失，固有層完整，牙齦纖維及牙周膜纖維排列整齊(圖3A)；肥胖對照組牙周組織與健康對照組大致相同，尚未發(fā)生附著喪失，僅在固有層見少許炎細胞浸潤(圖3B)；肥胖伴實驗性牙周炎組溝內上皮呈現糜爛和潰瘍，有明顯附著喪失，上皮向根方增殖，形成牙周袋，上皮下層和固有層炎細胞浸潤明顯，牙槽骨吸收，表明實驗性牙周炎模型建立成功(圖3C).與肥胖伴實驗性牙周炎組比較，牙周治療組的炎細胞浸潤減少，附著喪失依舊存在(圖3D).牙周組織HE染色結果表明，肥胖因素僅輕微加重大鼠局部牙周組織的炎癥狀態(tài)，而在肥胖基礎上，實驗性牙周炎使大鼠牙周組織出現明顯的炎癥和附著喪失，表明實驗性牙周炎模型建立成功.牙周治療可以有效改善肥胖伴實驗性牙周炎組大鼠牙周組織的炎癥狀態(tài)，但已破壞的牙槽骨和附著水平無法恢復.

周齡/周組別體質量4健康對照組79.18±5.41 肥胖對照組81.43±6.55 8健康對照組333.38±24.67肥胖對照組348.30±28.7712健康對照組502.20±36.38肥胖對照組534.27±28.841)16健康對照組567.56±37.01肥胖對照組608.47±34.871)20健康對照組651.08±49.36肥胖對照組750.80±77.061)21健康對照組678.50±68.08肥胖對照組740.36±98.721)肥胖伴實驗性牙周炎組735.84±82.841)24健康對照組695.98±80.00肥胖對照組763.43±109.741)肥胖伴實驗性牙周炎組786.89±96.341)牙周治療組772.17±87.411)26健康對照組704.87±82.99肥胖對照組838.89±75.621)肥胖伴實驗性牙周炎組806.98±60.931) 牙周治療組825.74±25.191)

1)與健康對照組相比，P<0.05

表2 大鼠Lee’s指數變化Table 2 Lee’s index during the experiment

1)與健康對照組相比，P<0.05

A:健康對照組;B:肥胖對照組;C:肥胖伴實驗性牙周炎組;D:牙周治療組;CEJ：釉牙骨質界；BPP：牙周袋底；GF：牙齦纖維

2.3 非手術性牙周治療對肥胖伴實驗性牙周炎大鼠腎臟及腎功能的影響

腎臟外觀結果顯示，健康對照組的腎臟表面光滑，呈紅褐色(圖4A)；高脂飲食喂養(yǎng)后，大鼠腎臟顏色鮮紅，腎門處及被膜均出現大量脂肪(圖4B、C、D).其中，肥胖伴實驗性牙周炎組腎臟脂肪內見血管充血(圖4C)，而牙周治療組的充血程度有所改善(圖4D)，說明非手術性牙周治療可以改善肥胖伴實驗性牙周炎組大鼠腎臟的炎癥充血狀態(tài).

HE染色顯示，健康對照組腎小管上皮細胞呈錐形，細胞核位于近基底膜一側，管腔一側有刷毛緣(圖5A)；肥胖對照組表現為細胞質空泡性變和顆粒樣變(圖5B)；肥胖伴實驗性牙周炎組腎小管管腔內有脫落的細胞碎片，管腔一側刷毛緣呈多灶性斷裂，且部分細胞核由原有的基底膜一側向管腔側移動(圖5C)；牙周治療組呈現部分空泡性變和刷毛緣脫落，但較肥胖伴實驗性牙周炎組有所減輕(圖5D).腎臟組織HE染色結果表明，肥胖可使大鼠腎臟組織結構出現早期損傷性改變，復合牙周炎后這種病理改變進一步惡化，而這種早期腎臟損傷在牙周治療后得到了有效的緩解.

血清肌酐結果顯示，肥胖對照組血清肌酐值顯著高于健康對照組(P=0.002)，肥胖伴實驗性牙周炎組的血清肌酐值顯著高于健康對照組(P=0.000)，表明肥胖導致健康大鼠腎功能出現一定異常；與肥胖對照組相比，肥胖伴實驗性牙周炎組大鼠血清肌酐值繼續(xù)升高，但尚無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，表明復合實驗性牙周炎后，肥胖大鼠腎臟功能出現繼續(xù)惡化趨勢，但實驗性牙周炎尚不足以改變腎功能水平；牙周治療組的血清肌酐顯著下降，明顯低于肥胖對照組和肥胖伴實驗性牙周炎組(P=0.001)，表明牙周治療可改善肥胖大鼠的腎臟功能.四組之間血清尿素氮無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見表3)，其原因可能是血清尿素氮的變化受到多種因素影響，對實驗性牙周炎及非手術性牙周治療不敏感.

上述結果表明，肥胖造模后大鼠會出現早期腎功能損傷；復合牙周炎后，大鼠腎功能異?？赡芗又?，而牙周治療在一定程度上改善大鼠腎臟病理和功能損傷.

A:健康對照組;B:肥胖對照組;C:肥胖伴實驗性牙周炎組;D:牙周治療組

A:健康對照組;B:肥胖對照組;C:肥胖伴實驗性牙周炎組;D:牙周治療組

表3 各組血清腎功能指標
Table 3 Biomakers of renal function

組別n血清肌酐血清尿素氮健康對照組824.88±1.645.74±0.28肥胖對照組828.25±2.251)5.71±0.75肥胖伴實驗性牙周炎組830.13±2.471)6.04±0.85牙周治療組826.38±1.512)5.80±0.51F值10.2800.430P值0.0000.734

1)與健康對照組相比，P<0.05；2)與肥胖伴實驗性牙周炎組比較，P<0.05

2.4 非手術性牙周治療對肥胖伴實驗性牙周炎大鼠腎臟氧化應激狀態(tài)的影響

與健康對照組相比，肥胖對照組腎臟MDA、8-OHdG水平顯著升高(P=0.013, 0.025)，SOD活力、GSH水平顯著下降(P=0.000, 0.013)，提示肥胖可加重健康大鼠腎臟的氧化應激狀態(tài)；與肥胖對照組相比，肥胖伴實驗性牙周炎組腎臟MDA、8-OHdG、SOD活力及GSH水平的變化尚無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示在肥胖基礎上，實驗性牙周炎雖有持續(xù)惡化肥胖大鼠腎臟氧化應激狀態(tài)的趨勢，但尚不足以改變其水平；與肥胖伴實驗性牙周炎組相比，牙周治療組腎臟MDA和8-OHdG水平顯著降低(P=0.048, 0.038)，GSH水平顯著升高(P=0.041)，SOD活力無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明非手術性牙周治療有效地緩解了肥胖伴實驗性牙周炎大鼠腎臟氧化應激狀態(tài)(見表4).

表4 各組腎臟氧化應激指標Table 4 Biomakers of oxidative stress

1)與健康對照組相比，P<0.05；2)與肥胖伴實驗性牙周炎組相比，P<0.05

3 討論

本實驗從氧化應激的角度來探討實驗性牙周炎對肥胖大鼠腎臟功能的影響，以及牙周治療對其的改善作用.高脂飼料喂養(yǎng)16周后，肥胖對照組大鼠體質量及Lee’s指數均較健康對照組顯著增加，提示肥胖大鼠模型建立成功.在整個實驗期間，各組大鼠的體質量隨著時間推移而不斷增加，但相同時間點肥胖伴實驗性牙周炎組與肥胖對照組及牙周治療組比較，體質量的改變無統(tǒng)計學差異，提示實驗性牙周炎及非手術性牙周治療對大鼠體質量無明顯影響.腎臟功能和組織病理相關指標結果顯示，肥胖造模后，大鼠腎小管上皮細胞出現細胞質空泡性變和顆粒樣變性，血清肌酐水平顯著增高，表現出早期腎臟功能損傷；在肥胖基礎上復合實驗性牙周炎后，大鼠腎小管上皮細胞病理改變加重，呈現刷毛緣多灶性斷裂，腎小管管腔內有脫落的細胞碎片，部分細胞核向管腔側移動，血清肌酐水平雖有繼續(xù)增高，但尚無統(tǒng)計學差異，提示大鼠腎功能異常可能加重；拆除結扎絲、進行牙周治療后，腎臟病理和血清肌酐均得到一定改善.在肥胖造模、牙周炎造模和牙周治療整個實驗過程中，大鼠的體質量不斷增加.在此前提下，非手術性牙周治療仍改善了大鼠腎臟病理和血清肌酐指標，基本可以排除肥胖本身對腎功能的影響.血清肌酐和尿素氮是綜合反映腎功能的常用指標.血清肌酐是一種內生肌酐，是估算腎小球濾過率最普遍使用的內源性標志物[15]，臨床上血肌酐升高時，常提示存在急、慢性腎炎導致的腎小球濾過功能減退，一般與尿素氮同時測定更有意義，當兩者均升高時，提示腎臟發(fā)生嚴重損傷.尿素氮是人體蛋白質分解代謝的終末產物，90%以上通過腎臟排泄.然而，本實驗中血清尿素氮水平在四組大鼠之間組間并無統(tǒng)計學差異.有研究表明，腎損害發(fā)生的早期，血清尿素氮可在正常范圍內，且受到多種因素影響，只有發(fā)生嚴重腎功能損傷時，血清尿素氮才會明顯升高[16].

當牙周組織發(fā)生炎癥時，中性粒細胞來源的活性氧(ROS)水平升高，從而對組織產生一系列破壞，包括脂質過氧化物產生、DNA損傷、蛋白質損傷，導致局部和全身的氧化應激[17].而過量的ROS會使腎臟氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，導致腎臟結構和功能的損傷[18].

脂質過氧化和DNA損傷是氧化應激導致組織損傷的直接形式.其中，MDA是脂質過氧化的最終分解產物, 是氧自由基產生增多的標志，研究發(fā)現，慢性腎衰腹膜透析大鼠血清中的MDA含量增高[19]；8-OHdG是DNA損傷的重要指標，隊列研究[20]發(fā)現，血漿8-OHdG濃度升高與1型糖尿病患者腎臟疾病風險增加獨立相關.SOD與GSH為重要的抗氧化劑，另有研究表明，慢性腎衰的Wistar大鼠腎臟SOD活力下降[21]，創(chuàng)傷也會導致肥胖Zucker大鼠腎臟SOD活力下降[22]，Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠腎臟中游離GSH濃度顯著降低，線粒體GSH濃度降低更為明顯[23].本研究發(fā)現，肥胖造模后，大鼠腎臟氧化應激指標中，MDA和8-OHdG水平顯著升高，GSH水平顯著降低，SOD活力明顯抑制，表明腎臟氧化應激水平增加，與上述研究發(fā)現基本一致；在肥胖基礎上復合牙周炎后，MDA和8-OHdG水平繼續(xù)升高，GSH水平繼續(xù)降低，SOD活力繼續(xù)下降，但各指標變化尚未能顯示出統(tǒng)計學差異，說明實驗性牙周炎有惡化肥胖大鼠腎臟氧化應激水平的趨勢，但尚未顯著改變其水平；經非手術性牙周治療后，在肥胖大鼠在體質量繼續(xù)增加的情況下，大鼠腎臟MDA和8-OHdG水平顯著降低，GSH水平顯著升高，提示非手術性牙周治療可能改善了大鼠腎臟氧化應激的水平，該結果仍需進一步證實.

總之，本研究發(fā)現實驗性牙周炎可能加重肥胖大鼠早期腎臟病理變化和腎功能異常程度，該變化與氧化應激水平增加有關，而非手術性牙周治療可改善肥胖復合牙周炎大鼠腎臟功能和氧化應激狀態(tài).對于本實驗中，與肥胖對照組比較，肥胖伴實驗性牙周炎組的某些指標的改變未能顯示出統(tǒng)計學差異這一現象，分析其原因可能是動物樣本量不足，實驗性牙周炎結扎時間不夠長.針對這些不足，后期研究將擴大樣本量，優(yōu)化牙周造模方法和時間，排除其他不可控的復雜因素，進一步驗證本研究結果.