高糖、低氧對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞新生功能影響的體外研究

蔡梅峰， 崔永生， 何文凱， 李明琰， 應(yīng)虹柳， 曾國(guó)鵬

(廣州醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科, 廣東 廣州 511400)

2型糖尿病患者微血管病變發(fā)生較早，當(dāng)發(fā)生缺血性損傷時(shí)，組織恢復(fù)灌注的能力明顯受損，這導(dǎo)致冠心病的發(fā)病率和死亡率迅速上升[1-2].2型糖尿病患者微血管病變的發(fā)生可能與心臟微血管的新生功能障礙有關(guān).大量研究表明，低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是細(xì)胞在低氧條件下調(diào)節(jié)血管新生的關(guān)鍵因子[3-4]，對(duì)下游眾多促進(jìn)血管新生的基因，尤其是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有重要的調(diào)控作用[5].Dengler等[6]的研究表明，低氧可上調(diào)HIF-1α表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)VEGF的表達(dá)，但高糖(葡萄糖)條件下、低氧合并高糖條件下HIF-1α和VEGF的表達(dá)情況及對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMEC)新生功能的影響報(bào)道尚少.本研究應(yīng)用高糖及低氧條件下培養(yǎng)大鼠CMEC模擬2型糖尿病缺血心肌微血管的病理狀態(tài)，旨在探究高糖、低氧、高糖合并低氧時(shí)CMEC的HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)水平及其增殖、遷移、成管能力的變化.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與耗材

內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)(貨號(hào)1001)購自美國(guó)Sciencell公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(貨號(hào)16000-044)、青鏈霉素混合液(貨號(hào)15140-122)、胰蛋白酶(貨號(hào)25200056)、無糖DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)11966)購自美國(guó)Gibco公司；Ⅱ型膠原酶(貨號(hào)C6885)、葡萄糖(glucose,Glu)(貨號(hào)G7528)、DAPI染色液(貨號(hào)S0091)購自美國(guó)Sigma公司；兔抗大鼠CD31多克隆抗體(貨號(hào)77699)、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(貨號(hào)4412)購自美國(guó)CST公司；CCK8試劑盒(貨號(hào)CK04)購自日本同仁研究所；5×PrimeScript RT Master Mix(貨號(hào)RR036A)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(貨號(hào)RR820)購自日本TaKaRa公司；transwell小室(貨號(hào)3421)、Matrigel 基質(zhì)膠(貨號(hào)356234)、離心管(貨號(hào)430791)、細(xì)胞培養(yǎng)板(貨號(hào)3599/3524/3516)、培養(yǎng)皿(貨號(hào)430166/430167)、200目網(wǎng)狀過濾器(貨號(hào)352340)購自美國(guó)Corning公司；水合氯醛(貨號(hào)S24149)購自北京鼎國(guó)生物有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛(貨號(hào)P0099)、體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100(貨號(hào)ST795)購自中國(guó)碧云天公司.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠10只，12周齡，體質(zhì)量為250～300 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)20130034.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SD大鼠心臟CMEC的分離培養(yǎng)

參考Nishida等[7]消化分離大鼠CMEC的方法.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉處死SD大鼠后取其左心室，在體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中浸泡30 s，HBSS緩沖液清洗3遍，將心肌組織在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶中剪碎，在37 ℃振蕩水浴中溫育30 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的胰蛋白酶后繼續(xù)水浴震蕩30 min，然后終止消化，200目網(wǎng)狀過濾器過濾消化后的液體，在25 ℃下，100 g/min離心5 min，將細(xì)胞懸浮于ECM完全培養(yǎng)基(ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為5%的胎牛血清+體積分?jǐn)?shù)為1%的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物+體積分?jǐn)?shù)為1%的青鏈霉素混合液)中，接種于用層粘連蛋白預(yù)處理45 min的培養(yǎng)皿中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液，之后每3 d換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%后，用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化傳代.取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).

1.2.2 CMEC的鑒定

細(xì)胞消化傳代接種于放有細(xì)胞爬片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%，棄去培養(yǎng)基，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定10 min，體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100破膜10 min，PBS洗3次后加入正常羊血清室溫封閉30 min，滴加兔抗大鼠CD31抗體于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加入羊抗兔二抗后避光室溫孵育50 min，用PBS洗3次，加入DAPI染色液，避光室溫孵育10 min，PBS洗3次，晾干后滴上適量的抗猝滅封片劑，蓋上載玻片，避免氣泡，熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照.

1.2.3 CMEC的分組處理

將培養(yǎng)的CMEC分為4組，每組培養(yǎng)時(shí)均用ECM完全培養(yǎng)基，在加處理因素前12 h換為無血清無糖DMEM培養(yǎng)基，具體分組見表1：

表1 分組處理情況Table 1 The process of the groups

1.2.4 Real-time PCR法檢測(cè)CMEC的HIF-1α、VEGF的mRNA表達(dá)水平

每組再培養(yǎng)48 h后，采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后使用TaKaRa擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增.HIF-1α的上游引物為5′-ACAGCACATTCA-CAGCTCCCCA-3′，下游引物為5′-TGTGGCTACC-ATGTACTGCTGGC-3′；VEGF的上游引物為5′-GGAGTACCCCGATGAGATAGAGT-3′，下游引物為5′-CTATGTGCTGGCTTTGGTGAG-3′；內(nèi)參β-actin的上游引物為5′-TCAGGTCATCACTATC-GGCAAT-3′，下游引物為5′-AAAGAAAGGGTG-TAAAACGCA-3′，在熒光定量PCR儀上的擴(kuò)增條件是：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共循環(huán)40次.用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量.

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)CMEC的增殖能力

每組加處理因素再培養(yǎng)48 h后，使用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，把細(xì)胞濃度調(diào)整為 2×104個(gè)/mL.在96孔板每孔中接種100 μL的細(xì)胞懸液，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后向每孔中加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值.

1.2.6 transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CMEC的遷移能力

每組加處理因素再培養(yǎng)48 h后，使用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，把細(xì)胞濃度調(diào)整為 5×105個(gè)/mL.按每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于transwell侵襲小室的上室，而在下室內(nèi)加入500 μL ECM完全培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后取出小室，用棉簽將上室內(nèi)細(xì)胞輕輕擦拭干凈，用甲醇室溫固定20 min，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫染色3 min，用PBS沖洗干凈后晾干，在×100顯微鏡下觀察拍照.

1.2.7 體外小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CMEC的成管能力

48孔培養(yǎng)板、200 μL槍頭、基質(zhì)膠4 ℃過夜預(yù)冷，用預(yù)冷的槍頭加100 μL基質(zhì)膠于預(yù)冷48孔培養(yǎng)板中，37 ℃包被30 min.每組加處理因素再培養(yǎng)48 h后，使用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，把細(xì)胞濃度調(diào)整為 2×105個(gè)/mL，每孔接種200 μL單細(xì)胞溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h.在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用Image-Pro計(jì)數(shù)由內(nèi)皮細(xì)胞圍成完整的毛細(xì)血管管腔的數(shù)量.

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CMEC的鑒定

DAPI(藍(lán)色熒光)和CD31(綠色熒光)雙染色后，CMEC會(huì)雙陽性表達(dá).熒光染色結(jié)果顯示，所分離細(xì)胞中雙陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的95%以上，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)(圖1).

A：DAPI染色后細(xì)胞核可見藍(lán)色熒光；B：CD31染色后細(xì)胞漿可見綠色熒光；C：A、B合成圖

A：Blue fluorescence can be seen in the nucleus after DAPI staining；B：Green fluorescence can be seen in cytoplasm after CD31 staining；C：A, B Composite picture

圖1 熒光染色鑒定心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(×100)

Fig.1 Assessment of cardiac microvascular endothelial cells with fluorescent staining (×100)

2.2 各組細(xì)胞HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)

HIF-1α的mRNA表達(dá)水平在NG組與HG組之間、HNG組與HHG組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明氧氣的體積分?jǐn)?shù)相同時(shí)，高糖對(duì)CMEC的HIF-1αmRNA表達(dá)影響不明顯； HNG組HIF-1α的mRNA表達(dá)水平明顯高于NG組(P<0.05)，HHG組HIF-1α的mRNA表達(dá)水平明顯高于HG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時(shí)，低氧可促進(jìn)CMEC的HIF-1αmRNA表達(dá)(圖2).

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05

NG組VEGF的mRNA表達(dá)水平高于HG組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，HNG組VEGF的mRNA表達(dá)水平明顯高于HHG組(P<0.05)，表明氧氣的體積分?jǐn)?shù)相同時(shí)，高糖可抑制CMEC的VEGFmRNA表達(dá)；HNG組VEGF的mRNA表達(dá)水平明顯高于NG組(P<0.05)，HHG組VEGF的mRNA表達(dá)水平明顯高于HG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時(shí)，低氧可促進(jìn)CMEC的VEGFmRNA表達(dá)(圖3).

2.3 各組細(xì)胞的增殖能力

NG組細(xì)胞的增殖能力明顯高于HG組(P<0.05)，HNG組細(xì)胞的增殖能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明氧氣的體積分?jǐn)?shù)相同時(shí)，高糖可抑制CMEC增殖；NG組細(xì)胞的增殖能力明顯高于HNG組(P<0.05)，HG組細(xì)胞的增殖能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時(shí)，低氧可抑制CMEC增殖(圖4).

2.4 各組細(xì)胞的遷移能力

NG組細(xì)胞的遷移能力明顯高于HG組(P<0.05)，HNG組細(xì)胞的遷移能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明氧氣的體積分?jǐn)?shù)相同時(shí)，高糖可抑制CMEC遷移；NG組細(xì)胞的遷移能力明顯高于HNG組(P<0.05)，HG組細(xì)胞的遷移能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時(shí)，低氧可抑制CMEC遷移(圖5).

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05；3)與HNG組比較，P<0.05

圖3VEGF的mRNA表達(dá)水平

Fig.3 The expression level ofVEGFmRNA

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05；3)與HNG組比較，P<0.05

圖4 細(xì)胞的增殖能力

Fig.4 The proliferation of the cells

2.5 各組細(xì)胞的成管能力

NG組細(xì)胞的成管能力明顯高于HG組(P<0.05)，HNG組細(xì)胞的成管能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明體積分?jǐn)?shù)相同時(shí)，高糖可抑制CMEC小管形成能力；NG組細(xì)胞的成管能力明顯高于HNG組(P<0.05)，HG組細(xì)胞的成管能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時(shí)，低氧可抑制CMEC小管形成能力(圖6).

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05；3)與HNG組比較，P<0.05

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05；3)與HNG組比較，P<0.05

3 討論

CMEC對(duì)調(diào)節(jié)血管內(nèi)平衡有至關(guān)重要的作用，不但可以為血管提供一個(gè)功能性屏障，還可參與血管舒縮功能的調(diào)節(jié)，對(duì)血管壁抗血小板、抗炎、抗增殖和抗氧化信號(hào)的調(diào)控也有重要作用[8].2型糖尿病會(huì)損害心肌微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管新生障礙，心肌微血管生成不足，心臟毛細(xì)血管密度降低，側(cè)支循環(huán)減少，心肌處于缺血缺氧狀況，從而增加了心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn).Marfella等[9]研究表明，鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制心肌梗死模型后，其心肌梗死面積大于非糖尿病大鼠和血糖控制良好的糖尿病大鼠，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這與HIF-1α的基因表達(dá)減少有關(guān).Catrina等[10]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病動(dòng)物模型的傷口中HIF-1α和HIF-1靶基因的水平降低，導(dǎo)致細(xì)胞缺氧、傷口愈合時(shí)間延長(zhǎng).HIF-1α廣泛參與多種基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，在低氧環(huán)境下，HIF-1α與靶基因低氧反應(yīng)元件結(jié)合,促進(jìn)包括VEGF在內(nèi)的眾多血管生成因子基因的轉(zhuǎn)錄翻譯及心肌的能量代謝[11].因此推測(cè)高糖通過影響HIF-1α的表達(dá)而引起VEGF的表達(dá)減少，可能是糖尿病患者心肌微血管新生障礙的發(fā)生機(jī)制.

本研究在不同濃度的葡萄糖和不同體積分?jǐn)?shù)的氧氣的條件下培養(yǎng)大鼠CMEC，檢測(cè)促血管生成因子HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)和CMEC增殖、遷移、成管能力的變化.Real-time PCR結(jié)果表明，葡萄糖的濃度相同時(shí)，低氧環(huán)境中HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)水平均明顯高于常氧，提示低氧是促進(jìn)HIF-1αmRNA表達(dá)的重要因素，HIF-1αmRNA表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)了下游VEGF的表達(dá).氧氣的體積分?jǐn)?shù)相同時(shí)，葡萄糖濃度的高低對(duì)HIF-1α的mRNA表達(dá)沒有顯著影響，而高糖則會(huì)降低VEGF的mRNA表達(dá)，可能的機(jī)制是，高糖不會(huì)影響HIF-1α的基因表達(dá)，但是可能會(huì)降低HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性.那么，高糖是通過什么機(jī)制降低HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性的？有研究表明，高糖的作用可以被甘露醇模擬代替[12]，提示可能與滲透壓升高有關(guān)；Botusan等[13]的研究認(rèn)為糖尿病大鼠心肌HIF-1α與下游基因結(jié)合的活性降低，會(huì)使其目的基因如VEGF表達(dá)下降；也有研究顯示，高糖條件下糖代謝異常導(dǎo)致細(xì)胞和血漿中甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)水平升高，影響了HIF-1α蛋白與P300/CBP蛋白的聚合，使得VEGF的上調(diào)受到抑制[14].

缺氧是對(duì)機(jī)體的一種損傷，組織發(fā)生缺血缺氧時(shí)能量利用會(huì)發(fā)生障礙，無氧代謝產(chǎn)物蓄積，細(xì)胞功能紊亂甚至導(dǎo)致組織壞死.但是正常機(jī)體對(duì)缺氧是有代償作用的，比如，在發(fā)生心肌梗死時(shí)，心臟血管新生正向調(diào)節(jié)因子表達(dá)會(huì)增強(qiáng)，啟動(dòng)血管新生過程，建立側(cè)支循環(huán)[15].然而糖尿病患者對(duì)缺氧的反應(yīng)會(huì)減弱，已有臨床研究和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，伴有2型糖尿病的心肌梗死患者，心肌組織的毛細(xì)血管密度明顯降低，梗死面積增加，并且更容易發(fā)生心梗后心絞痛以及充血性心力衰竭[9].高糖會(huì)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧家族(reactive oxygen species，ROS)的生成，激活蛋白激酶C通路或晚期糖基化終產(chǎn)物形成通路等，從而誘導(dǎo)CMEC損傷[16-17].這些與本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高糖和低氧環(huán)境損傷CMEC的增殖能力、遷移能力和小管形成能力是一致的.

綜上所述，高糖不但降低了缺氧環(huán)境下大鼠CMEC促血管生成因子的基因表達(dá)，而且損傷了細(xì)胞的增殖、遷移和小管形成能力，提示我們，對(duì)于2型糖尿病合并心肌缺血患者，可以通過強(qiáng)化控制血糖及外源補(bǔ)充促血管生成相關(guān)因子來減輕高糖低氧對(duì)CMEC新生能力的影響，減輕臨床癥狀、改善預(yù)后，為2型糖尿病合并缺血性心臟病的研究提供新的思路.但是，HIF-1α下游信號(hào)分子錯(cuò)綜復(fù)雜，許多通路尚不能完全闡明，故仍有許多問題等待解決.