多囊卵巢綜合征大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡及VEGF-A的表達(dá)

王立群， 周月希, 張娟

(1.中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖中心， 湖北 武漢 430070； 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床學(xué)院， 湖北 武漢 430070)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女中最常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病之一，也是造成女性無(wú)排卵性不孕的主要原因，雖然藥物治療可恢復(fù)PCOS患者的排卵功能，但患有PCOS的女性發(fā)生早期妊娠流產(chǎn)的概率是正常婦女的4倍[1]，且PCOS患者相關(guān)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率是其他女性的3倍[2]，提示PCOS患者子宮內(nèi)膜功能存在失常.PCOS患者內(nèi)分泌代謝失常的主要表現(xiàn)有高雄激素、胰島素抵抗等，對(duì)子宮內(nèi)膜造成了復(fù)雜影響，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜功能失常的機(jī)制尚未被完全闡明.

自1976年Hopwood[3]發(fā)現(xiàn)人的子宮內(nèi)膜存在細(xì)胞凋亡小體以來(lái)，越來(lái)越多的研究表明子宮的許多病理變化都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，但是關(guān)于PCOS子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡尚未清楚.豐富表達(dá)于子宮內(nèi)膜的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular enthedolial growth factor，VEGF)，是一種多功能細(xì)胞因子，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)血管生成的作用，與胚胎著床以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4].本研究通過(guò)觀察PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的凋亡情況以及VEGF-A的表達(dá)變化，探討細(xì)胞凋亡以及VEGF-A在PCOS子宮內(nèi)膜發(fā)生功能失常的過(guò)程中可能起到的作用.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用21日齡雌性SPF級(jí)SD大鼠20只，體質(zhì)量50～60 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[SCXX(鄂)2015-0018]提供,在湖北省疾病預(yù)防控制中心屏障環(huán)境[SYXK(鄂)2017-0065]中飼養(yǎng),溫度控制在(22±2)℃，相對(duì)濕度為50%～60%，自由飲食，光照周期為日夜各12 h.

1.1.2 主要試劑與儀器

硫酸普拉睪酮鈉購(gòu)自青島捷世康生物科技有限公司；注射用水購(gòu)自浙江瑞新藥廠；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司；抗熒光淬滅封片劑購(gòu)自Southernbiotech公司；DR5、DcR2兔多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；內(nèi)參兔抗β-actin抗體購(gòu)自Proteintech公司.小鼠IgG-免疫組化試劑盒與HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自博士德生物工程有限公司；DAB試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物有限公司；RIPA裂解液、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白濃度定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒與DAPI購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司.

YD6L生物組織包埋機(jī)為金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；RM2016輪轉(zhuǎn)型切片機(jī)為上海徠卡儀器有限公司產(chǎn)品；BX51奧林巴斯熒光顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；DYY-7C電泳儀、垂直與轉(zhuǎn)移電槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品；RT-6500酶標(biāo)分析儀為深圳雷杜公司產(chǎn)品；DB3000凝膠圖像分析儀為中國(guó)天能公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立

按文獻(xiàn)[5-6]，21日齡雌性SD大鼠，斷乳，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，23日齡時(shí)隨機(jī)分為兩組，每組10只.其中一組為實(shí)驗(yàn)組，大鼠每日給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90 mg/g按硫酸普拉睪酮鈉皮下注射，相當(dāng)于脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60 mg/g用0.4 mL注射用水溶解，連續(xù)注射20 d，建立PCOS大鼠模型，該組設(shè)為PCOS組；另一組設(shè)為對(duì)照組，每日皮下注射0.4 mL注射用水，連續(xù)注射20 d.所有大鼠注射后第21日晨用體積分?jǐn)?shù)為4%水合氯醛麻醉，解剖取卵巢、子宮，分離表面多余組織，體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，備用.

1.2.2 HE染色

將制備好的4 μm厚子宮石蠟切片分別脫蠟至水，蘇木素染色1.5 min，流水沖洗返藍(lán)，顯微鏡下觀察核藍(lán)紫色，體積分?jǐn)?shù)為100%乙醇浸泡3 min，伊紅染色10 s，體積分?jǐn)?shù)為100%乙醇浸泡10 s，觀察細(xì)胞質(zhì)紅色，晾干，中性樹(shù)脂封片后，用倒置顯微鏡觀察子宮形態(tài)變化.

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取大鼠子宮石蠟切片脫蠟至水，滴加質(zhì)量濃度為20 μg/mL的蛋白酶K工作液，20 ℃～37 ℃反應(yīng)15～30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；加入100 μL DNaseⅠ在15 ℃～25 ℃孵育10 min，吸水紙擦干玻片后加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(50 μL TdT+450 μL 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻)于標(biāo)本上，37℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min 4次洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干玻片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后顯示藍(lán)色熒光，發(fā)生凋亡的細(xì)胞經(jīng)TUNEL反應(yīng)混合液染色后顯示紅色熒光.各組每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍高倍視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野的所有細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)并計(jì)算凋亡率.

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)VEGF-A蛋白的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)技術(shù)SABC即鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法：大鼠子宮石蠟切片，分別脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)為3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，用PBS按1∶200稀釋VEGF-A小鼠單克隆一抗抗體4 ℃過(guò)夜，生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗，用PBS按1∶150稀釋?zhuān)?7 ℃孵育35 min；用PBS按1∶150稀釋SABC，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間5～10 min，自來(lái)水洗后蘇木素復(fù)染，晾干，中性樹(shù)膠封片.采用日本奧林巴斯BX51熒光顯微鏡成像，400倍高倍視野下，觀察子宮中VEFA-A蛋白的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色，由Image-Pro Plus計(jì)算細(xì)胞內(nèi)棕黃色區(qū)域面積(Area)及光密度值(IA)，平均光密度值(A)為兩者之比(IA/Area)，棕黃色著色越深，對(duì)應(yīng)的A值越大，蛋白表達(dá)越強(qiáng)，反之則反.

1.2.5 Western blot檢測(cè)VEGF-A蛋白的表達(dá)水平

取大鼠子宮組織，加入組織裂解液，碾磨勻漿，離心取上清，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以6 μL樣品每泳道行質(zhì)量濃度為8% SDS-PAGE凝膠電泳約90 min，根據(jù)目的蛋白分子量切膠，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉1 h，相應(yīng)分子量范圍PVDF膜分別加入VEGF-A(1∶200)和β-actin(1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育2 h，ECL發(fā)光液顯色，以β-actin為內(nèi)參，用ImageJ圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶光密度值，計(jì)算目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶吸光度的比值，即蛋白的相對(duì)含量.

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮光鏡HE染色觀察

PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目與對(duì)照組相比明顯減少，腺體多為單個(gè)分散排列，腺腔比較小，少有迂曲，而對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目較多，腺體多呈簇狀排列，腺腔較大，迂曲較多(圖1).

A：PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜，腺體多為單個(gè)分散排列，腺腔較小.B：對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜，腺體多呈簇狀排列，腺腔較大.

A: The endometrium of rats in PCOS group, the glands are mostly arranged in a single dispersion, and the glandular cavity is small. B: The endometrium of rats in control group, the glands are mostly clustered, and the glandular cavity is larger.

圖1 PCOS組與對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜(HE染色，×200)

Fig.1 The endometrium in rats with PCOS group and control group (HE staining, ×200)

2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)生率

TUNEL染色結(jié)果顯示，PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表1、圖2).

2.3 免疫組織化學(xué)染色觀察VEGF-A的表達(dá)

VEGF-A的陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的棕黃色染色，在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，且主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，VEGF-A在PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少(P<0.05，表1、圖3).

表1 各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率以及VEGF-A的表達(dá)

組別凋亡率/%VEGF-A對(duì)照組5.878±0.688 50.148 3±0.006 3PCOS組2.096±0.581 41)0.106 8±0.009 11)

1)與對(duì)照組子宮相比，P<0.05.

A，B，C：PCOS組；D，E，F(xiàn)：對(duì)照組.PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡數(shù)與對(duì)照組相比明顯減少.

A, C, E: PCOS group; B, D, F: control group. The number of apoptosis of endometrial glandular epithelial cells in the PCOS group was significantly reduced compared with the control group.

圖2 熒光顯微鏡觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡情況(TUNEL法，×400)

Fig.2 The apoptosis of endometrial cells in each group was observed by fluorescence microscope.(TUNEL method，×400)

A：PCOS組；B：對(duì)照組. PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF-A的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯減少.

A: PCOS group; B: Control group. The expression of VEGF-A in the endometrium of rats in the PCOS group was significantly reduced compared with the control group.

圖3 VEGF-A在各組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)(SABC法，×400)

Fig.3 Expression of VEGF-A in the endometrium of rats in each group(SABC method，×400)

2.4 Western blot檢測(cè)VEGF-A蛋白的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果表明，PCOS組大鼠子宮中VEGF-A蛋白表達(dá)較對(duì)照組減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩組蛋白表達(dá)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖4).

1)與對(duì)照組相比P<0.05

Fig.4 Expression levels of VEGF-A protein in the uterus of rats in each group

3 討論

PCOS是育齡期婦女最常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)無(wú)排卵、高雄激素血癥、糖代謝異常、胰島素抵抗等.Haoula等[2]研究表明PCOS患者發(fā)生子宮內(nèi)膜增生的概率為5%～10%，發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)是健康人群的3倍.PCOS患者持續(xù)無(wú)排卵會(huì)使子宮內(nèi)膜長(zhǎng)期受雌激素刺激而無(wú)孕酮拮抗，子宮內(nèi)膜細(xì)胞有絲分裂活躍性及細(xì)胞突變率增加，此外雌激素還可刺激子宮內(nèi)膜雌激素受體的表達(dá)增多，使子宮內(nèi)膜對(duì)雌激素的反應(yīng)增高[7]，進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)膜增生.雄激素既可與雄激素受體結(jié)合抑制DNA的合成進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，又可促進(jìn)芳香化酶mRNA的合成進(jìn)而可轉(zhuǎn)化為雌二醇，間接促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖[8]，有研究表明，PCOS患者增生的子宮內(nèi)膜中芳香化酶P450 mRNA表達(dá)增加[9]，提示高雄激素在PCOS內(nèi)分泌的環(huán)境中可能更傾向于轉(zhuǎn)化為雌激素促進(jìn)內(nèi)膜增殖.糖代謝異常和胰島素抵抗普遍存在于非典型子宮內(nèi)膜增生和子宮內(nèi)膜癌患者中[10]，近年來(lái)胰島素抵抗在PCOS患者子宮內(nèi)膜增生病變中所起到的作用已得到共識(shí)[11]，作為一種重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，胰島素不僅能調(diào)節(jié)糖代謝，還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡，因而具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖的作用，此外，胰島素抵抗和糖代謝紊亂，可能通過(guò)降低性激素結(jié)合蛋白水平[12]而增加了血清游離雌激素的水平，進(jìn)而加強(qiáng)促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生的作用.由此可見(jiàn)，PCOS內(nèi)分泌代謝失常對(duì)子宮內(nèi)膜造成了極其復(fù)雜的影響，目前PCOS子宮內(nèi)膜功能失常的機(jī)制尚未完全明了.

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主性的程序死亡，是多細(xì)胞生物正常發(fā)育和保持穩(wěn)態(tài)的一個(gè)至關(guān)重要的過(guò)程.在正常的子宮內(nèi)膜中，細(xì)胞凋亡多見(jiàn)于分泌晚期和月經(jīng)期，在增生期和分泌初期開(kāi)始時(shí)很少檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡通過(guò)清除子宮內(nèi)膜功能層的衰老細(xì)胞來(lái)維持內(nèi)膜組織正常結(jié)構(gòu)和功能[13].子宮內(nèi)膜的病理性改變常會(huì)伴有細(xì)胞凋亡的異常改變，研究表明，子宮內(nèi)膜癌早期患者的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡調(diào)控表現(xiàn)異常[14]，子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜細(xì)胞具有更高的增殖活性，其凋亡水平較正常人明顯降低[15].本研究首先構(gòu)建PCOS大鼠模型，采用TUNEL法檢測(cè)各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的凋亡率顯著降低，由于細(xì)胞凋亡減少可能導(dǎo)致PCOS子宮內(nèi)膜中衰老細(xì)胞以及癌變細(xì)胞不能及時(shí)清除，從而使子宮內(nèi)膜發(fā)生增厚甚至癌變，故推測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡減少可能也是PCOS患者容易發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的原因之一.PCOS子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡減少考慮跟雌激素長(zhǎng)期刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞有絲分裂及高胰島素水平促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等密切相關(guān).

VEGF是一種對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異促有絲分裂作用的糖蛋白，與相應(yīng)受體結(jié)合后具有促進(jìn)血管生成和維持血管通透性的作用，是調(diào)節(jié)血管生成的重要因子.目前已知的VEGF家族成員包括VEGF-A、B、C、D、F以及胎盤(pán)生長(zhǎng)因子6種，其中VEGF-A常簡(jiǎn)稱(chēng)為VEGF，VEGF在子宮內(nèi)膜中呈周期性表達(dá)，受卵巢分泌的雌孕激素調(diào)節(jié)[4]，是子宮內(nèi)膜分泌的主要血管生成因子，而正常女性子宮內(nèi)膜呈周期性變化，與子宮血管的生成與退化密切相關(guān)[16]，故VEGF在維持女性子宮正常生殖功能的過(guò)程中起到重要作用.本研究顯示，VEGF-A在PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，由于VEGF-A可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖使子宮內(nèi)膜變厚，推測(cè)PCOS大鼠子宮內(nèi)膜VEGF-A表達(dá)減少可能是子宮內(nèi)膜增生過(guò)度的一種代償性作用.Gordon等[17]研究表明上皮膜蛋白-2(epithelial membrane protein-2，EMP2)可通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成，而應(yīng)用的EMP-2 IgG-1治療減少VEGF的表達(dá)后，腫瘤負(fù)荷顯著降低，子宮內(nèi)膜癌患者生存率顯著提高，提示VEGF促血管生成的作用還參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展，而PCOS患者發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)較高，那么PCOS子宮內(nèi)膜中VEGF-A的表達(dá)下調(diào)是否在PCOS發(fā)展成為子宮內(nèi)膜癌的過(guò)程中起到一定的抵抗作用，有待于進(jìn)一步的研究.

綜上，PCOS子宮內(nèi)膜功能失?？赡芘c子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡減少有關(guān)，細(xì)胞凋亡減少導(dǎo)致子宮內(nèi)膜中的衰老細(xì)胞和癌變細(xì)胞無(wú)法得到及時(shí)清除，子宮內(nèi)膜發(fā)生增生甚至癌變，而VEGF-A的表達(dá)下調(diào)可能是PCOS子宮內(nèi)膜增生過(guò)度產(chǎn)生的一種代償性作用，通過(guò)減少血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，減輕子宮內(nèi)膜增生程度，延緩PCOS患者發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)程.