血管生成相關(guān)因子在口腔白斑癌變過(guò)程中的表達(dá)及意義

王亞敏 孟文霞 周震 韓倩倩 資云玲

南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院（廣州510280）

口腔黏膜白斑（oral leukoplakia）是公認(rèn)的口腔癌的癌前病變，病變率約為4%～40%，口腔白斑伴有上皮異常增生時(shí)，惡變潛能隨上皮異常增生程度的增加而增大。白斑癌變是一個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)過(guò)程，經(jīng)歷了由正常黏膜到單純?cè)錾?、異常增生再到原位癌、浸?rùn)癌的演變［1］。白斑異常增生程度直接決定了其癌變潛能［2］。所以深入了解口腔白斑癌變的發(fā)病機(jī)制及白斑的早期治療十分重要。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與腫瘤組織中微血管生成密切相關(guān)。血管生成被認(rèn)為是連接慢性炎癥和腫瘤之間的橋梁，過(guò)度的血管生成同時(shí)也是多種慢性炎癥和腫瘤進(jìn)一步發(fā)展的標(biāo)志［3-5］。新生血管為惡性腫瘤持續(xù)惡性生長(zhǎng)提供必要的氧和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；同時(shí)被惡性腫瘤用來(lái)排除代謝物質(zhì)，成為播散和轉(zhuǎn)移的最直接通道。因此，抑制血管的生長(zhǎng)、控制血行轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移就能使得腫瘤的發(fā)生發(fā)展得到有效控制，從而得到有效的干預(yù)［4］。

細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecular，ICAM-1）和血管細(xì)胞間黏附分子-1（vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1）屬于細(xì)胞黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成員，均為調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間結(jié)合、起黏附作用的一類膜表面糖蛋白。ICAM-1 和VCAM-1 在介導(dǎo)細(xì)胞免疫機(jī)制、炎性疾病及腫瘤等多種生理、病理過(guò)程中均有重要作用［5-6］。近年國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1 可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展［9］；sVCAM-1/sICAM-1 比率可作為診斷子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物［7］；內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的早期指標(biāo)，其特征是過(guò)度表達(dá)黏附分子包括ICAM-1 和VCAM-1［8］；血清sICAM-1 的濃度可作為判斷鼻咽癌發(fā)生程度及療效評(píng)價(jià)的指標(biāo)；大腸癌細(xì)胞上ICAM-1 的過(guò)度表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；ICAM-1 表達(dá)增加促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移［9］等。研究多集中在炎癥及癌組織方面，那么ICAM-1 和VCAM-1 在癌前病變中是否存在表達(dá)，在口腔黏膜白斑癌變過(guò)程中是否存在表達(dá)變化目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)ICAM-1 和VCAM-1 在正?？谇火つ?、白斑伴輕-中度異常增生、白斑癌變組織中的表達(dá)，探討ICAM-1 和VCAM-1 對(duì)口腔白斑癌變的影響，為口腔白斑癌變的早期診斷和靶向治療提供新途徑。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集 收集我院病理科2018年以前存放的口腔白斑伴輕-中度異常增生組織10 例、口腔白斑癌變組織10 例，均排除患有其他口腔黏膜疾病、系統(tǒng)性疾病及近3 個(gè)月內(nèi)使用過(guò)免疫制劑者。所有樣本均經(jīng)病理學(xué)診斷確診，符合口腔白斑伴輕-中度異常增生（1972年WHO 關(guān)于上皮異常增生12 項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)）及口腔鱗狀細(xì)胞癌（UICC，2002版）的病理學(xué)特點(diǎn)。收集我院正頜外科患者術(shù)后多余的正常口腔黏膜標(biāo)本15 例，行石蠟包埋，作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑 ICAM-1 鼠抗人單克隆抗體（1∶3 000；Abcam，美國(guó)）和VCAM-1 鼠抗人單克隆抗體（1∶200；Abcam，美國(guó)）。免疫組化染色試劑盒（DakoCytomation EnVision system）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 石蠟標(biāo)本連續(xù)切片后置于二甲苯2 次，再依次置于體積分?jǐn)?shù)100%、95%、80%、70%酒精溶液脫蠟至水。然后將切片置于EDTA 抗原修復(fù)緩沖液（pH 9.0）中進(jìn)行抗原修復(fù)，再將切片置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫溶液中室溫避光孵育25 min 后，用PBS 洗滌3 次后血清封閉。小心甩去封閉液，滴加按一定比例配好的一抗置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，加生物素化二抗37 ℃孵育50 min。磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，DAB 顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止；蘇木素復(fù)染30 s，自來(lái)水沖洗15 min；氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，加拿大樹(shù)膠封片。所有標(biāo)本均在同一條件下染色。

1.4 免疫組化染色結(jié)果判定 ICAM-1 和VCAM-1陽(yáng)性表達(dá)判斷：ICAM-1 和VCAM-1 陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒或棕色顆粒。兩人雙盲法觀察切片。每例切片選取10 個(gè)高倍鏡（400 倍）視野下計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算ICAM-1（+）和VCAM-1（+）細(xì)胞表達(dá)百分率（%）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究中連續(xù)型變量和分類變量分別以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差和頻數(shù)（百分比）表示。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，組間變量采用t檢驗(yàn)，在顯著性水平5%的標(biāo)準(zhǔn)下，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICAM-1 和VCAM-1 在正常口腔黏膜、口腔白斑伴輕-中度上皮增生及口腔白斑癌變組織的表達(dá) 在15 例正常對(duì)照組中，ICAM-1 和VCAM-1全部呈陰性表達(dá)，觀察不到棕黃色顆粒沉積。在10 例白斑輕-中度異常增生組及10 例白斑癌變組均有陽(yáng)性著色，ICAM-1 表達(dá)集中在基底膜下方區(qū)域，ICAM-1 和VCAM-1 在間質(zhì)中內(nèi)皮細(xì)胞和炎細(xì)胞胞漿中陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖1、2。

2.2 ICAM-1 和VCAM-1 在正常口腔黏膜、口腔白斑伴輕-中度異常增生及口腔白斑癌變的3 組表達(dá)對(duì)比情況 ICAM-1 和VCAM-1 的陽(yáng)性細(xì)胞百分率各組間相互比較，組間差異均具有顯著意義（P＜0.05，表1、2）?？谇话装甙┳兘M高于口腔白斑伴輕中度異常增生組高于正常黏膜組。

表1 各組ICAM-1 陽(yáng)性細(xì)胞百分率統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Descriptive statistics for ICAM-1expression in all groups

圖1 ICAM-1 在口腔正常黏膜、白斑伴輕-中度異常增生、白斑癌變組中的表達(dá)（免疫組化）Fig.1 The expression of ICAM-1 in nomal，oral leukoplakia with mild to moderate epithelial dysplasia and oral leukoplakia canceration tissues（IHC）

圖2 VCAM-1 在口腔正常黏膜、白斑伴輕-中度異常增生、白斑癌變組中的表達(dá)（免疫組化）Fig.2 The expression of VCAM-1 in nomal，oral leukoplakia with mild to moderate epithelial dysplasia and oral leukoplakia canceration tissues（IHC）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，ICAM-1 和VCAM-1 在正常黏膜組織中呈陰性表達(dá)。兩種黏附分子均表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中，正常組織中不表達(dá)或低水平表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示ICAM-1 和VCAM-1在口腔白斑伴輕-中度異常增生及白斑癌變組織的間質(zhì)中陽(yáng)性表達(dá)，并且隨著白斑癌變過(guò)程表達(dá)呈升高趨勢(shì)；ICAM-1 集中表達(dá)在基底膜下方區(qū)域，VCAM-1 在間質(zhì)中可見(jiàn)，該兩種黏附分子陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域均可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞。由于ICAM-1 的主要受體為淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-1（lymphocyte associated antigen-1，LFA-1），表達(dá)在淋巴細(xì)胞和除紅細(xì)胞以外的所有造血細(xì)胞；VCAM-1 的主要受體為緩慢抗原-4（very late antigen-4，VLA-4），選擇性地促進(jìn)單個(gè)核白細(xì)胞的黏附。研究［10］認(rèn)為ICAM-1和LFA-1 結(jié)合反應(yīng)對(duì)于淋巴細(xì)胞黏附并遷移至炎癥區(qū)域起重要作用；血清sICAM-1 與LFA-1 的結(jié)合可以制約循環(huán)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞，幫助腫瘤細(xì)胞逃過(guò)自身免疫識(shí)別從而更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。sICAM-1 對(duì)血管再生和刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)也起重要作用［5］。研究結(jié)果提示ICAM-1 和VCAM-1 可能與炎性細(xì)胞共同參與了白斑癌變的過(guò)程；該兩種黏附分子隨著癌變過(guò)程表達(dá)升高，在一定程度上可以反映癌前病變的可能性。

此外，ICAM-1 和VCAM-1 可作為新生血管形成的生理性指標(biāo)［8］，并對(duì)調(diào)節(jié)白細(xì)胞跨血管內(nèi)皮運(yùn)動(dòng)和炎癥反應(yīng)起重要作用［10-11］。研究［12］顯示在白斑癌變過(guò)程中組織的微血管密度逐漸增高，血管內(nèi)皮因子VEGF 的表達(dá)隨著白斑異常增生到癌變過(guò)程中呈升高趨勢(shì)，這與該兩種黏附分子表達(dá)趨勢(shì)一致。正常細(xì)胞進(jìn)展成新生瘤狀態(tài)需要以下條件：獲得生長(zhǎng)信號(hào)、抗生長(zhǎng)信號(hào)的不敏感；抵抗細(xì)胞死亡且具有無(wú)限復(fù)制能力；持續(xù)的血管生成、組織浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移；促進(jìn)腫瘤的炎癥反應(yīng)、基因組不穩(wěn)定和突變能力［18］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在白斑異常增生、癌變的過(guò)程中，ICAM-1 和VCAM-1 的升高不僅促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)血管生成，微血管密度增加，促進(jìn)了癌變的進(jìn)程；隨著表達(dá)增加，淋巴細(xì)胞與其黏附，腫瘤細(xì)胞憑借黏附的淋巴細(xì)胞黏附到血管上皮上并滲出血管外，播散到其他部位，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視生長(zhǎng)浸潤(rùn)。所以ICAM-1 和VCAM-1 參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移多個(gè)過(guò)程。

綜上所述，ICAM-1 和VCAM-1 在口腔白斑癌變過(guò)程中起了重要作用。隨著抗血管生成療法逐漸成為腫瘤治療的新策略，臨床上檢測(cè)ICAM-1 和VCAM-1 有望作為口腔白斑是否發(fā)生癌變的指標(biāo)；同時(shí)該抗體在口腔白斑治療中具有潛在應(yīng)用前景。