乙肝肝硬化患者中微小RNA-21、Th9 的表達(dá)及其對(duì)腸道屏障功能調(diào)控機(jī)制的影響

趙彩紅 田志穎 張麗賢 何顯 蘇新愛 王麗華

衡水哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院消化內(nèi)科（河北衡水053000）

微小RNAs（miRNAs）是一種大小在21～23 個(gè)堿基之間的單鏈小分子RNA，可參與調(diào)節(jié)、影響細(xì)胞增殖、脂肪代謝及細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡，與許多疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)［1］。miR-21 最初在小鼠體內(nèi)被檢測(cè)出，是普遍的腫瘤相關(guān)性miRNA。相關(guān)研究報(bào)道m(xù)iR-21 在慢性肝炎患者肝組織中下調(diào)，而在肝硬化患者肝組織中上調(diào)，但是具體的機(jī)制還不明確［2-3］。乙肝肝硬化患者常伴有不同程度的炎癥反應(yīng)，炎癥因子通過介導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷參與調(diào)節(jié)肝硬化的發(fā)?。?］。輔助性T 淋巴細(xì)胞9（Th9）是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T 細(xì)胞亞群，具有促炎效應(yīng)，在炎癥性疾病中也發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用［5］。肝硬化發(fā)展過程中常伴隨著不同程度的腸屏障功能障礙，可誘發(fā)與加重腸源性內(nèi)毒素血癥［6-7］。腸道屏障功能狀態(tài)可以通過腸黏膜的通透性來反映，可通過檢測(cè)血中二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、內(nèi)毒素（endotoxin，ET）、D-乳酸（D-lactic acid，D-lac）含量進(jìn)行判定［8-9］。本研究具體探討了乙肝肝硬化患者中miR-21、Th9 的表達(dá)及其對(duì)腸道屏障功能調(diào)控機(jī)制的影響，以明確肝硬化與腸道屏障的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 研究時(shí)間為2014年2月至2018年2月，此次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者知情同意本研究。采用回顧性總結(jié)研究方法，選擇在哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院診治的乙肝肝硬化患者144 例作為肝硬化組，納入標(biāo)準(zhǔn)：影像學(xué)檢查提示肝硬化改變；除外其他原因?qū)е碌母斡不?；既往存在乙肝病史或HBsAg 陽(yáng)性≥6 個(gè)月，現(xiàn)HBsAg 和（或）HBV DNA 仍為陽(yáng)性者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重呼吸道、泌尿系及其他部位的感染；乙肝肝硬化同時(shí)合并其他類型肝硬化；乙肝病毒以外的其他類型肝炎病毒感染；妊娠或哺乳期婦女；合并肝外膽道梗阻疾病、代謝性疾病、免疫系統(tǒng)疾病等。

同期選擇體格檢查健康者144 例作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)肝損害表現(xiàn)；無飲酒史；無肝炎病毒感染史，肝炎病毒學(xué)結(jié)果陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重呼吸道、泌尿系及其他部位的感染；合并惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)及代謝類疾病病史；妊娠或哺乳期婦女；合并心臟、腦、膽、肺、腎等器質(zhì)性疾病。

肝硬化組中男74 例，女70 例；年齡24～76 歲，平均（48.22±8.29）歲；平均病程為（8.19±0.78）年；平均體質(zhì)量指數(shù)為（23.11±2.48）kg/m2。對(duì)照組中男76 例，女68 例；年齡21～79 歲，平均（48.42 ±4.28）歲；平均體質(zhì)量指數(shù)為（23.98 ± 2.11）kg/m2。兩組患者上述資料對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 采集所有入選者的空腹靜脈血5～10 mL，1 500 r/min 離心5 min，取上清，采用速率法測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）含量，檢測(cè)儀器為美國(guó)貝克曼全自動(dòng)分析儀。

1.3 miR-21、Th9、DAO、ET、D-lac 指標(biāo)檢測(cè) 取1.2 部分中的靜脈血樣本，每200 μL 血液樣本中加入等體積裂解液，采用天根科技有限公司miRNA提取分離試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-21 特異性引物應(yīng)用DNAMAN 軟件設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，序列為：5′-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3′。PCR條件：94 ℃2 min，（94 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s）持續(xù)40 個(gè)循環(huán)，40 ℃10 s。PCR 反應(yīng)結(jié)束后分析反應(yīng)曲線，Real-time 分析采用2-ΔΔCt法進(jìn)行。

取1.2 部分中的全血標(biāo)本100 μL，分離PBMC，加入等體積的不含血清的RPMI 1640，加入1 μg/mL PMA 工作液50 μg/mL、0.1 mg/mL Momensin 工作液3.4 μL、Iomomycin 工作液4 μL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，加入5 μg CD3-FITC 和5 μg CD8-PE-cy5，避光孵育15 min，固定后再次加入鼠抗IgG1-PE，IL-9-PE，重懸后1 200 r/min 離心5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th9細(xì)胞所占比例。

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清DAO、ET、D-lac 含量，檢測(cè)試劑盒來自大連賽拓生物科技有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)與計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）、百分比、例數(shù)表示，行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)等，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ALT、TBIL、AST 含量對(duì)比 肝硬化組的血清ALT、TBIL、AST 含量都高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組ALT、TBIL、AST 含量對(duì)比Tab.1 Comparison of ALT，TBIL and AST contents in two groups ±s

表1 兩組ALT、TBIL、AST 含量對(duì)比Tab.1 Comparison of ALT，TBIL and AST contents in two groups ±s

組別肝硬化組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)144 144 ALT（U/L）188.39±45.29 26.20±10.29 23.198 0.000 AST（U/L）142.20±45.21 30.78±9.91 17.339 0.000 TBIL（μmol/L）102.49±22.84 34.29±11.81 15.292 0.000

2.2 miR-21 相對(duì)表達(dá)量與Th9 含量對(duì)比 肝硬化組的miR-21 相對(duì)表達(dá)量與Th9 含量都高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組miR-21 相對(duì)表達(dá)量與Th9 含量對(duì)比Tab.2 Relative expression of microRNA-21 and Th9 in two groups ±s

表2 兩組miR-21 相對(duì)表達(dá)量與Th9 含量對(duì)比Tab.2 Relative expression of microRNA-21 and Th9 in two groups ±s

組別肝硬化組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)144 144 miR-21（2-ΔΔCt）4.55±1.04 1.54±0.33 8.385 0.002 Th9 0.48±0.11 0.40±0.08 6.793 0.009

2.3 腸道屏障功能指標(biāo)對(duì)比 肝硬化組的血清ET、DAO 與D-lac 值高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組腸道屏障功能指標(biāo)對(duì)比Tab.3 Comparison of intestinal barrier function between two groups ±s

表3 兩組腸道屏障功能指標(biāo)對(duì)比Tab.3 Comparison of intestinal barrier function between two groups ±s

組別肝硬化組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)144 144 ET（EU/L）265.40±89.29 145.20±67.19 11.094 0.000 D-lac（μmol/mL）78.20±10.48 42.00±9.10 7.894 0.004 DAO（ng/mL）207.03±76.22 120.49±57.21 8.963 0.001

2.4 相關(guān)性分析 在肝硬化組中，直線相關(guān)分析顯示血清ET、DAO、D-lac 與ALT、TBIL、AST、miR-21、Th9 都呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性（P＜0.05）。見表4。

表4 乙肝肝硬化患者腸道屏障功能與常規(guī)指標(biāo)、miR-21、Th9 的相關(guān)性（n=144）Tab.4 The correlation between intestinal barrier function and routine parameters，miR-21 and Th9 in patients with hepatitis cirrhosis（n=144）

3 討論

當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的miRNA 接近萬(wàn)個(gè)，可在血清中穩(wěn)定地存在［10］。miRNA 可利用自身調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)水平從而影響疾病的進(jìn)程，并且其變化程度還與疾病的分型分級(jí)以及預(yù)后密切相關(guān)。miR-21 與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，定位于大約離染色體5q32 處。miR-21 在結(jié)腸癌、子宮頸癌、胃癌、B 細(xì)胞淋巴瘤患者中下調(diào)，當(dāng)前有研究發(fā)現(xiàn)miR-21 在單獨(dú)乙肝患者標(biāo)本中下調(diào)，在乙肝肝硬化患者標(biāo)本中上調(diào)［11］。有研究顯示抑制miR-21 表達(dá)可遏制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力及侵襲力，上調(diào)miR-21 表達(dá)可提高腫瘤細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移及侵襲能力，遏制細(xì)胞凋亡，促使惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展［12］。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)CD4+Th 細(xì)胞除Th1 細(xì)胞和Th2 細(xì)胞外，Th9 細(xì)胞在許多疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用［13］。有研究［14］顯示在缺乏IL-4 的情況下，TGF-β1 可誘導(dǎo)初始T 細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，起到抑制炎癥的作用，當(dāng)加入IL-4 后初始T 細(xì)胞顯著向Th9 轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生致炎效應(yīng)。本研究顯示肝硬化組的miR-21 相對(duì)表達(dá)量與Th9 含量都高于對(duì)照組（P＜0.05），表明乙肝肝硬化患者的miR-21 呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，同時(shí)Th9 的含量升高，表明為免疫失衡狀態(tài)。從機(jī)制上分析，乙肝肝硬化患者體內(nèi)肝細(xì)胞HBV 復(fù)制強(qiáng)烈，但是HBV 并不能直接導(dǎo)致肝細(xì)胞病變，miR-21 在此條件下可調(diào)節(jié)NF-κB 的表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)HBV 復(fù)制的作用［15］。

腸道屏障主要由物理屏障、生物屏障、化學(xué)屏障、免疫障礙等組成，特別是相關(guān)免疫活性物質(zhì)構(gòu)成的免疫屏障發(fā)揮著重要的作用。肝臟具有雙重血供，可負(fù)責(zé)收集胃腸道等多數(shù)消化器官的血液［16］。當(dāng)腸道屏障的完整性遭到破壞時(shí)，大量細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物將穿過腸屏障進(jìn)入血液，可影響肝臟固有免疫系統(tǒng)的平衡［17］。相關(guān)研究［18］顯示肝硬化患者肝細(xì)胞功能受損后，血管活性腸肽、前列環(huán)素等物質(zhì)合成增多，導(dǎo)致腸黏膜血管擴(kuò)張、瘀血，使得腸黏膜通透性增加。特別是內(nèi)毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生的一氧化氮可使腸上皮結(jié)構(gòu)疏松而增加通透性，導(dǎo)致益生菌減少，而致病菌增加，促使發(fā)生細(xì)菌移位。本研究顯示肝硬化組的血清ET、DAO 與D-lac 值高于對(duì)照組（P＜0.05）。ET是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中的一種成分，血清中ET主要來自于腸道里面內(nèi)毒素的吸收，可反映腸黏膜通透性改變，也可反映腸源性內(nèi)毒素血癥的嚴(yán)重程度。D-Lac是腸道多種細(xì)菌發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，當(dāng)腸屏障破壞時(shí)，D-Lac 吸收增加，使得血中D-Lac水平升高［19］。DAO存在于腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)，并且95%以上位于小腸黏膜絨毛；當(dāng)腸屏障損傷時(shí)，腸黏膜通透性增加，可使血清DAO水平升高，為此，DAO可作為反映腸黏膜通透性的客觀指標(biāo)［20］。

本研究直線相關(guān)分析顯示乙肝肝硬化患者的血清ET、DAO、D-lac 與ALT、TBIL、AST、miR-21、Th9 都呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性（P＜0.05）。從機(jī)制上分析，隨著肝硬化病情的加重，腸黏膜屏障的完整性受損，腸道內(nèi)的內(nèi)毒素、D-Lac 移位入血，引起血內(nèi)毒素和D-Lac 異常升高［21］。還有研究顯示肝硬化伴門脈高壓時(shí)的D-Lac、DAO、ET 值較非門脈高壓顯著升高，當(dāng)出現(xiàn)肝硬化時(shí)，可減弱腸黏膜上皮的修復(fù)能力，從而破壞腸屏障［22］。血清miR-21 可通過細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間信號(hào)通路來參與由HBV 介導(dǎo)的乙肝肝硬化發(fā)生過程，這可能是對(duì)乙肝肝硬化發(fā)生與發(fā)展通路的重要補(bǔ)充。不過本研究也有一定的不足，miR-21 的多功能特性、所調(diào)節(jié)靶基因的多樣性決定了其在不同背景下具有不用的作用機(jī)制，并且miR-21 在不同的標(biāo)本中的表達(dá)水平會(huì)有不同，其作用機(jī)制還有待深入分析。

總之，乙肝肝硬化患者中miR-21、Th9 都呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，也表現(xiàn)為腸道屏障功能紊亂狀態(tài)，兩者可互相形成，形成惡性循環(huán)，從而參與乙肝肝硬化的發(fā)生與發(fā)展。