二乙基亞硝胺對(duì)肝臟過(guò)表達(dá)miR-155 轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌發(fā)生的影響

陳麗 林霞 關(guān)燕紅 林曉琳 肖東 杜弢

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州510260）；2南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所（廣州510515）

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA 分子，對(duì)靶基因的表達(dá)起負(fù)向調(diào)控的作用。miRNAs 的作用機(jī)制是與RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物結(jié)合后，互補(bǔ)結(jié)合靶mRNA 的3′-UTR 區(qū)，降解靶mRNA 或者阻止靶mRNA 轉(zhuǎn)錄后的翻譯［1-3］。miR-155在多種人體腫瘤組織中異常表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等密切相關(guān)，被認(rèn)為是癌性微小RNA（oncomiR）［4-6］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 過(guò)表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖和裸鼠皮下成瘤，而下調(diào)miR-155則抑制HCC細(xì)胞增殖和裸鼠皮下成瘤［7-9］，以上研究結(jié)果表明，miR-155 可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，但目前尚缺動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。Cre/lox P 系統(tǒng)通過(guò)Cre 重組酶特異性識(shí)別lox P 位點(diǎn)，對(duì)DNA 片段進(jìn)行刪除、倒置和易位。調(diào)控Cre 基因的表達(dá)，即可在體內(nèi)外調(diào)控靶基因的表達(dá)，因此Cre/lox P系統(tǒng)已成為一種廣泛應(yīng)用的基因操作工具［10-11］。為更準(zhǔn)確模擬miR-155 在人體上起始某種腫瘤發(fā)生的過(guò)程，有必要借助基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)（如Cre/lox P 系統(tǒng)）建立條件性過(guò)表達(dá)miR-155 的轉(zhuǎn)基因小鼠。為此，本實(shí)驗(yàn)制備了攜帶多個(gè)報(bào)告基因（RFP 和Luc）的Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠，運(yùn)用Cre/lox P 系統(tǒng)成功建立了肝臟特異性過(guò)表達(dá)miR-155的Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)miR-155 可以促進(jìn)DEN 誘導(dǎo)的小鼠肝癌的發(fā)生，這為揭示miR-155 在肝癌發(fā)生中的作用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體 質(zhì)粒pEμ-mmu-miR155（含318 bp 的小鼠miR-155 前體序列）由美國(guó)教授Carlo M.Croce（Ohio State University）惠贈(zèng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)性成熟C57BL/6（B6）小鼠和Alb-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠分別購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障設(shè)施內(nèi)。C57BL/6 小鼠用作以下群體：供受精卵用雌鼠和種公鼠，ICR小鼠用作以下群體：假孕母鼠和結(jié)扎雄鼠。本研究經(jīng)過(guò)本單位倫理委員會(huì)的審批。

1.1.3 主要試劑 PCR 擴(kuò)增試劑dNTP 和Taq 酶等、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和qRT-PCR 試劑盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTMII）均購(gòu)自TaKaRa 公司。TRIzol 試劑購(gòu)自ThermoFisher Scientific 公司。DEN購(gòu)自Sigma公司。β-catenin、cmyc 購(gòu)自Abcam 公司，p21 購(gòu)自博奧森公司，CCNG1購(gòu)自proteintech 公司，GSK3β、p-GSK3β購(gòu)自CST公司。

1.1.4 主要儀器 體內(nèi)可見(jiàn)光成像系統(tǒng)（Xenogen IVIS Spaectrum）為美國(guó)Caliper Life Sciences 公司產(chǎn)品，體視熒光顯微鏡（Nikon，AZ100）為Biometra公司產(chǎn)品，PCR 儀為BIO-RAD 公司產(chǎn)品，熒光定量PCR 儀LightCycleII 為Roche 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因片段Rm155LG制備 為制備轉(zhuǎn)基因片段Rm155LG，分別用SfiⅠ和SspⅠ酶切pRm155LG質(zhì)粒，膠回收9 154 kb 的轉(zhuǎn)基因片段，經(jīng)純化和定量，并經(jīng)過(guò)經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確，即可用于原核顯微注射法。轉(zhuǎn)基因片段Rm155LG 的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 轉(zhuǎn)基因片段Rm155LG 結(jié)構(gòu)和組成Fig.1 Schematic diagram of Rm155LG construct used to generate Rm155LG transgenic mice

1.2.2 原核顯微注射法制備Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠 采用常規(guī)分子生物學(xué)方法制備轉(zhuǎn)基因片段Rm155LG。本研究采用DNA 原核顯微注射法制備Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠，挑選注射后狀態(tài)良好C57BL/6 小鼠來(lái)源的單細(xì)胞受精卵，移植進(jìn)ICR 假孕母鼠輸卵管內(nèi)，仔鼠一般19.5～20.0 d 后出生。

1.2.3 篩選與鑒定Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠 剪取出生后2 周小鼠的部分鼠耳，置于小動(dòng)物活體成像儀或體視熒光顯微鏡下，mRFP 表達(dá)陽(yáng)性的為Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠。分別選取mRFP 陽(yáng)性小鼠和同窩對(duì)照小鼠，提取鼠耳組織的基因組DNA 進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），mRFP 擴(kuò)增采用引物對(duì)P1/P2（P1：5′-GGGAGCGCGTGATG AAC-3′，P2：5′-CGTTGTGGGAGGTGATGTC-3′），myo（作為內(nèi)參）擴(kuò)增采用引物對(duì)P3/P4（P3：5′-TTACGTCCATCGTGGACAGC-3′，P4：5′-TGGGCTGGGTGTTAGCCTTA-3′）。PCR 擴(kuò)增后，取5 μL 反應(yīng)液進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 運(yùn)用Cre/lox P系統(tǒng)建立肝臟過(guò)表達(dá)miR-155的Rm155LG/Cre雙轉(zhuǎn)基因小鼠 將Rm155LG轉(zhuǎn)基因小鼠與Alb-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，Cre 重組酶在雙轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)介導(dǎo)DNA 重組刪除轉(zhuǎn)錄終止盒片段后，將在肝臟特異性激活下游轉(zhuǎn)基因miR-155 和Luc 表達(dá)。腹腔注射底物D-luciferin（15 mg/kg）后，通過(guò)小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)出生后幾天的仔鼠的mRFP 和Luc 的表達(dá)，從而篩選出Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠。數(shù)周后，檢測(cè)Luc 陽(yáng)性和Luc 陰性子代小鼠活體和離體肝臟Luc 表達(dá)。

1.2.5 檢測(cè)Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中miR-155 轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平 選取Rm155LG/Cre雙轉(zhuǎn)基因和同窩對(duì)照小鼠，提取肝臟總RNA 并進(jìn)行cDNA 的合成（RT 引物序列如下：U6：AACGCTTCACGAATTTGCGT，miR-155：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCC），具體操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）。以cDNA 為模板，采用qRT-PCR的方法，分別擴(kuò)增U6（引物序列：上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′）和miR-155 基因（引物序列：上游：5′-GACTGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′），對(duì)小鼠肝臟中miR-155 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書（TB GreenTMPremix Ex TaqTMII）。

1.2.6 DEN 誘導(dǎo)小鼠肝癌模型的制備 選取出生后15 d 的Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩對(duì)照小鼠，給予腹腔注射DEN 25 mg/kg，6 個(gè)月后處死小鼠，取小鼠肝組織行大體形態(tài)學(xué)觀察和Western Blot 檢測(cè)。

1.2.7 Western Blot 檢測(cè)肝臟組織中肝癌相關(guān)基因的表達(dá) 提取肝臟組織總蛋白，用BCA 法蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白加樣10%SDS-PAGE 膠的孔槽中，電泳，然后將凝膠中的目的條帶轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，350 mA 電轉(zhuǎn)移120 min，室溫5%BSA 封閉1 h，加入抗β-catenin、c-Myc、p21、CCNG1、GSK3β和p-GSK3β抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST 洗滌3 次后，加入特異性二抗（1∶1 000）孵育1 h，PBST 洗滌后加入顯影液，使用高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍取照片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 miR-155 表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠的建立 采用DNA 原核顯微注射法制備Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠。將注射有轉(zhuǎn)基因片段Rm155LG 的382 枚受精卵移植給15 只假孕母鼠，其中4 只假孕母鼠懷孕［受孕率為27%（4/15）］，共生仔鼠35只［產(chǎn)仔率為9%（35/382）］。通過(guò)檢測(cè)mRFP 表達(dá)篩選出2 只Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠（編號(hào)：3313#和3314#）（圖2A），并借助PCR以進(jìn)一步明確篩選結(jié)果（圖2B）。

圖2 制備Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠Fig.2 Generation of Rm155LG transgenic mice

2.2 miR-155 在Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟上特異性過(guò)表達(dá) 將Rm155LG 轉(zhuǎn)基因雜合子小鼠與Alb-Cre 轉(zhuǎn)基因純合子小鼠交配，檢測(cè)所生后代的Luc 表達(dá)，部分子代小鼠肝臟部位可檢測(cè)到Luc 信號(hào)（圖3A）；與同窩對(duì)照小鼠相比，Luc 的表達(dá)可在Rm155LG/Alb-Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟上檢測(cè)到（圖3B）。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-155的RNA表達(dá)，miR-155的表達(dá)水平在Rm155LG/Alb-Cre雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟上顯著升高（P＜0.000 1）（圖3C）。以上數(shù)據(jù)均表明，Luc 和miR-155 轉(zhuǎn)基因在Rm155LG/Cre 雙 轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中成功被激活。

圖3 利用Cre/lox P 系統(tǒng)構(gòu)建肝臟特異過(guò)表達(dá)miR-155 的轉(zhuǎn)基因小鼠Fig.3 Liver-specific overexpression of mouse miR-155 in transgenic mice mediated by Cre/lox P system

2.3 DEN 誘導(dǎo)Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌發(fā)生情況 腹腔注射DEN 6 個(gè)月后，行肝臟大體形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)，Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟滿布大小不一的結(jié)節(jié)，與同窩對(duì)照小鼠相比，結(jié)節(jié)數(shù)量增多，直徑增大（圖4A）。Western blot 結(jié)果顯示，Rm155 LG/Alb-Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中肝癌相關(guān)基因如β-catenin、c-Myc、p21、CCNG1、GSK3β和p-GSK3β表達(dá)高于對(duì)照小鼠（圖4B），初步提示miR-155 可能促進(jìn)DEN 誘導(dǎo)的小鼠肝癌發(fā)生。

3 討論

肝細(xì)胞肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均居于惡性腫瘤的前幾位［12-13］，因此，尋找肝癌有效的治療新靶點(diǎn)十分迫切。研究表明，miR-155 可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，然而目前，miR-155 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確，并且缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)在Rm155LG/Cre雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟上實(shí)現(xiàn)了miR-155和Luc 轉(zhuǎn)基因特異性激活。通過(guò)構(gòu)建條件性過(guò)表達(dá)的Rm155LG轉(zhuǎn)基因小鼠，實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因和轉(zhuǎn)基因miR-155 在特定組織或器官被激活，可帶來(lái)以下便利：首先，可借助活體生物發(fā)光成像簡(jiǎn)便地監(jiān)測(cè)miR-155轉(zhuǎn)基因在特定組織或器官中是否被激活。其次，由于熒光素酶在與其特有底物熒光素反應(yīng)過(guò)程中可以產(chǎn)生大量可見(jiàn)光光子，在體內(nèi)、體外通過(guò)檢測(cè)Luc 發(fā)光強(qiáng)度，可間接反映出細(xì)胞的數(shù)量、腫瘤的大小和腫瘤轉(zhuǎn)移位置［14-15］。因此，可借助活體生物發(fā)光成像檢測(cè)Luc 信號(hào)的強(qiáng)弱，在Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠上非損傷、實(shí)時(shí)和可視化活體監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、消退、復(fù)發(fā)和體內(nèi)治療效果。

圖4 DEN 誘導(dǎo)Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌的發(fā)生Fig.4 DEN induces HCC in liver-specific overexpression miR-155 transgenic mice

DEN 是一種N-亞硝基化合物，常用于誘導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其在肝臟中引起損傷并誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的過(guò)程與人類肝癌的形成過(guò)程相似，因此，利用DEN 誘導(dǎo)小鼠肝癌的發(fā)生是理想的化學(xué)誘導(dǎo)性肝癌模型［16-17］。本實(shí)驗(yàn)利用DEN 誘導(dǎo)Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌發(fā)生，發(fā)現(xiàn)Rm155LG/Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟表面癌結(jié)節(jié)增多，與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)增高，提示DEN 誘導(dǎo)小鼠的肝癌不斷惡化可能與miR-155 在肝臟中高表達(dá)有關(guān)。下一步筆者將繼續(xù)探討miR-155 促進(jìn)DEN 誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制。

綜上所述，Rm155LG 轉(zhuǎn)基因小鼠的成功建立，將有助于全面解析miR-155 在多種生理和病理過(guò)程中的作用，并且Rm155LG/Alb-Cre 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的建立能為揭示miR-155 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供強(qiáng)大的體內(nèi)研究工具。本研究還通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-155 可以促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，表明miR-155 可能是肝癌治療的潛在新靶點(diǎn)。