柑桔胚乳培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化

李海林，聶振朋，柯甫志

（1臺州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江臺州 318020；2浙江省柑桔研究所）

我國是柑桔的重要原產(chǎn)地之一，柑桔資源豐富，優(yōu)良品種繁多，經(jīng)過長期栽培、選擇，柑桔成了人類的珍貴果品。柑桔果實既可鮮食，又可加工成果汁，深受廣大消費者的喜愛。我國柑桔品種資源雖然豐富，但栽培的品種多是有核甚至多核的，因而影響了商品價值和在國際市場上的競爭力[1]。

無核柑桔果實以其食用方便、品質(zhì)優(yōu)良而倍受人們的青睞，其無論在鮮食和加工上都具有重要意義。無核柑桔，育種上指平均單果種子數(shù)在3粒以下[2]，在商業(yè)上指平均單果種子數(shù)在5粒以下[3]。柑桔無核果有很多是天然形成的，但大部分無核品種是人為選育出來的。胚乳是雙受精產(chǎn)物之一，由1個精核和2個極核融合而成，是三倍體組織，由胚乳再生的植株通常也是三倍體，可產(chǎn)生無子果實。通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株，技術(shù)要求不高，三倍體得率高，嵌合體少，育種周期短，柑桔胚乳的離體培養(yǎng)是獲得三倍體無籽柑桔的重要途徑[4]。通過研究柑桔胚乳三倍體植株的誘導(dǎo)，以期獲得無核的三倍體胚乳再生植株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柑桔果實取自臺州科技職業(yè)學(xué)院果園，以果齡2個月左右的柑桔幼果為宜。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼果處理。將新鮮果實，用70%乙醇浸泡30s，再用0.1%HgCl2溶液浸泡6～7min，然后用無菌水沖洗3～4次，每次3～5min。再用干燥的無菌濾紙吸干種子表面的水分后，然后將果實放在滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)。

1.2.2 取胚乳。用流水沖洗預(yù)處理后的柑桔幼果30min左右，剝離出種子，將種子用0.1%HgCl2消毒6～7min。再用無菌水沖洗4～5次，每次3～5min。在超凈工作臺無菌條件下，在種子的合點端縱剖1刀，打開種子取出胚囊。輕輕擠壓胚囊的胚端，擠出幼胚，剝離出胚乳，選擇半透明狀固體、富有彈性的胚乳，單獨接種。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)。所用培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，對6-BA、2,4-D、sucrose濃度利用Minitab軟件正交設(shè)計優(yōu)化。正交設(shè)計的因素及水平分別為6-BA濃度 （0.5、1.0、1.5mg/L），2,4-D 濃度（0.2、0.4、0.6mg/L），sucrose（20、40、60g/L）（見表 1）。每個處理接種 l0 瓶。及時對其進(jìn)行形態(tài)觀察，50～60d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織塊數(shù)／接種個數(shù)。

1.2.4 不定芽誘導(dǎo)。獲得胚乳愈傷組織增殖培養(yǎng)后，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，對TDZ、NAA、sucrose濃度利用Minitab軟件正交設(shè)計優(yōu)化。正交設(shè)計的因素及水平分別為TDZ濃度（0.5、1.0、1.5mg/L），NAA 濃 度 （0.1、0.2、0.3mg/L），sucrose（20、40、60g/L）（見表 2）。每處理每次接種 20 塊愈傷組織。不定時觀察愈傷組織動態(tài)變化，50～60d后統(tǒng)計不定芽發(fā)生情況。

1.2.5 組培苗倍性鑒定。將不定芽接種于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～3周成苗。利用流式細(xì)胞儀對組培苗倍性進(jìn)行鑒定。鑒定方法參照陳城[5]報道的方法。

培養(yǎng)基pH值5.8～6.2。培養(yǎng)條件均為：溫度25℃，光照時間為12h/d，光照強(qiáng)度為2000Lx，瓊脂0.7%，活性炭濃度1.0mg/L。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)正交設(shè)計因素水平表

表2 不定芽誘導(dǎo)正交設(shè)計因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

由表4可知，3種因子對柑桔愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)的大小依次為6-BA＞2,4-D＞sucrose。說明同種類培養(yǎng)基中，不同濃度的6-BA對柑桔愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大，2,4-D次之，而sucrose的影響較小。鑒于以上分析，結(jié)合表3可知：柑桔愈傷組織誘導(dǎo)最佳組合為A2B1C2，也就是蔗糖6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+sucrose 40g/L，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)30%。

表3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基正交試驗L9（33）

表4 方差分析表

2.2 不定芽誘導(dǎo)

由表6可知，3種因子對不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)的大小依次為TDZ＞NA＞sucrose。說明同種類培養(yǎng)基中，不同濃度的TDZ對柑桔愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大，NAA次之，而sucrose的影響較小。鑒于以上分析，結(jié)合表5可知：柑桔不定芽誘導(dǎo)最佳組合為A1B2C2，也就是TDZ 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose 40g/L，不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)35%。

表6 方差分析表

2.3 植株形成與鑒定

不定芽在MS培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3周形成再生植株。鑒定結(jié)果如圖1。

圖1 倍性鑒定結(jié)果

3 結(jié)論

Gmitter[6]以及趙詠望等[7]早在20世紀(jì)90年代就從甜橙品種的胚乳中誘導(dǎo)出了三倍體植株。本試驗采用正交設(shè)計，研究不同激素的種類、濃度及其配比對柑桔組織培養(yǎng)的影響，與傳統(tǒng)試驗相比，本試驗?zāi)苋菁{更多的因素和水平，大大減少了試驗次數(shù)，提高準(zhǔn)確率[8]。利用流式細(xì)胞儀鑒定植物染色體的倍性，不受植物生長發(fā)育時期和環(huán)境條件的影響，取材部位可以是根、莖、葉片、花、果實、種子等器官，具有快速、準(zhǔn)確、簡單、高效的特點。已經(jīng)成功應(yīng)用于果樹、蔬菜、花卉等植物的倍性鑒定中[5]。試驗結(jié)果表明，不同的激素配比對柑桔胚乳愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)有很大的影響。本試驗中柑桔愈傷組織誘導(dǎo)最佳組合為：6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+sucrose 40g/L，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)30%；柑桔不定芽誘導(dǎo)最佳組合為：TDZ 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose 40g/L，不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)35%。